Δοκιμασίες ζυμομυκήτων με κυανό του μεθυλενίου: καταμέτρηση ζωντανών κυττάρων έναντι χρονομέτρησης της αναπνοής

Δύο σωλήνες βρίσκονται στον εργαστηριακό πάγκο. Και οι δύο είναι μπλε. Στον έναν, τα μπλε κύτταρα στο μικροσκόπιο σημαίνουν νεκρούς ζυμομύκητες. Στον άλλον, ένας σωλήνας που από μπλε γίνεται άχρωμος σημαίνει ότι οι ζυμομύκητες είναι ζωντανοί και αναπνέουν. Ίδια χρωστική, αντίθετες ερμηνείες. Αν συγχέετε τις δύο δοκιμασίες, κάθε συμπέρασμα αντιστρέφεται.

Αυτή η διάκριση είναι το θέμα ολόκληρου του άρθρου. Το κυανό του μεθυλενίου είναι οξειδοαναγωγική χρωστική: στην οξειδωμένη μορφή του είναι μπλε, ενώ στην ανηγμένη μορφή του είναι άχρωμο λευκοκυανό του μεθυλενίου. Η καταμέτρηση βιωσιμότητας αξιοποιεί αυτή τη χημεία σε ένα σύντομο μικροσκοπικό στιγμιότυπο. Ένα πείραμα αναπνοής την αξιοποιεί σε μια χρονομετρημένη αντίδραση στο σύνολο του δείγματος. Κάθε δοκιμασία χρειάζεται το δικό της πρωτόκολλο, τους δικούς της μάρτυρες και τη δική της κριτική αξιολόγηση.

Η καταμέτρηση βιωσιμότητας: σύντομη χρώση, άμεση παρατήρηση

Το πρωτόκολλο που χρησιμοποιείται στη ζυθοποιία είναι η πιο τυποποιημένη εκδοχή. Παρασκευάστε κυανό του μεθυλενίου 0.01% w/v σε κιτρικό νάτριο 2%, αναμείξτε το σε αναλογία 1:1 με το εναιώρημα ζυμομυκήτων και εξετάστε το μείγμα μετά από ένα σύντομο, σταθερό χρονικό διάστημα. Τα δημοσιευμένα διαστήματα κυμαίνονται από 1 έως 2 λεπτά στο εγχειρίδιο του Brewing Science Institute έως περίπου 5 λεπτά σε ερευνητικά πρωτόκολλα, ενώ η μέθοδος μικροβιολογίας οίνου του OIV απαιτεί εξέταση εντός 10 λεπτών. Η τελική συγκέντρωση της χρωστικής στο μείγμα καταμέτρησης είναι περίπου 0.005%. Γεμίστε έναν βελτιωμένο θάλαμο Neubauer και, σε μεγέθυνση περίπου 400x, ταξινομήστε τα σκούρα μπλε κύτταρα ως μη βιώσιμα και τα άχρωμα κύτταρα ως βιώσιμα. Στη μέθοδο του OIV, τα γαλάζια κύτταρα καταγράφονται ως ζωντανά, κάτι που ήδη υποδηλώνει το πρόβλημα υποκειμενικότητας που συζητείται παρακάτω.

Η συγκέντρωση των κυττάρων προκύπτει από τη γεωμετρία του θαλάμου. Όταν καταμετράται ολόκληρο το κεντρικό τετράγωνο πλευράς 1 mm, τα κύτταρα ανά mL ισούνται με N επί τον συντελεστή αραίωσης επί 10^4, όπου N είναι ο αριθμός κυττάρων σε αυτή την περιοχή, όπως ορίζεται στις μεθόδους του ASBC για ζυμομύκητες. Η βιωσιμότητα υπολογίζεται απλούστερα: άχρωμα κύτταρα διά του συνόλου των κυττάρων, επί 100. Καταμετρήστε περίπου 400 κύτταρα για μια εκτίμηση βιωσιμότητας, ακολουθώντας τη συγκριτική μελέτη ζυθοποιίας του FEMS και την πρακτική του OIV. Χρησιμοποιήστε σταθερά έναν κανόνα για τα όρια, για παράδειγμα συμπεριλαμβάνοντας τα κύτταρα στις κάτω και αριστερές γραμμές του πλέγματος και αποκλείοντας όσα βρίσκονται στις πάνω και δεξιές.

Για τα εκβλαστήματα χρειάζεται κανόνας πριν αρχίσει η καταμέτρηση. Μια συνηθισμένη σύμβαση καταμετρά ένα εκβλάστημα ως ξεχωριστό κύτταρο όταν φτάσει περίπου το μισό μέγεθος του μητρικού κυττάρου· όταν είναι μικρότερο, καταμετράται μαζί με το μητρικό. Όποιον κανόνα κι αν επιλέξετε, εφαρμόστε τον σε κάθε τετράγωνο και σημειώστε τον στο φύλλο εργασίας, ώστε το επόμενο άτομο να τον ακολουθήσει.

Φύλλο καταμέτρησης (εκτυπώστε το)

Αυτό το φύλλο εργασίας είναι πρωτότυπο υλικό για το άρθρο. Αντιγράψτε το σε ένα τετράδιο ή εκτυπώστε ένα για κάθε δείγμα.

Βιωσιμότητα (%) = 100 x άχρωμα / (άχρωμα + σκούρα μπλε). Συνολικά κύτταρα ανά mL = N x συντελεστής αραίωσης x 10^4, με το N να προκύπτει από την καθορισμένη περιοχή του θαλάμου. Καταγράψτε τον χρόνο χρώσης δίπλα στο αποτέλεσμα, επειδή μια τιμή βιωσιμότητας χωρίς τον χρόνο στον οποίο μετρήθηκε δεν είναι αναπαραγώγιμη.

Γιατί μεταβάλλονται οι τιμές βιωσιμότητας

Ο χρόνος είναι η πρώτη παρεμβολή και επηρεάζει το αποτέλεσμα και προς τις δύο κατευθύνσεις. Τα μεταβολικά ενεργά κύτταρα ανάγουν τη χρωστική, οπότε μια πρόωρη παρατήρηση μπορεί να καταγράψει ζωντανά κύτταρα πριν ολοκληρώσουν την αναγωγή της και να τα ταξινομήσει λανθασμένα ως νεκρά. Όμως η παρατεταμένη έκθεση είναι από μόνη της τοξική και δημιουργεί μπλε κύτταρα που έχουν πράγματι υποστεί βλάβη, προκαλώντας ψευδή ένδειξη θανάτου μέσω της χρώσης. Γι’ αυτό ένα εργαστηριακό διδακτικό πρωτόκολλο ορίζει αξιολόγηση εντός 5 λεπτών, όπως τεκμηριώνεται σε ένα διδακτικό πρωτόκολλο για ζυμομύκητες από το Wisconsin. Η ασφαλής διατύπωση είναι ότι η αξιολόγηση με κυανό του μεθυλενίου εξαρτάται από τον χρόνο· επομένως, ορίστε ένα σύντομο χρονικό διάστημα και διατηρήστε το σταθερό σε κάθε δείγμα μιας σειράς.

Τα δείγματα χαμηλής βιωσιμότητας παρουσιάζουν μια δεύτερη μεροληψία. Η τυποποιημένη μέθοδος προειδοποιεί ότι το κυανό του μεθυλενίου μπορεί να υπερεκτιμήσει την πραγματική βιωσιμότητα κάτω από περίπου 80%, επειδή τα κύτταρα που εξακολουθούν να ανάγουν τη χρωστική δεν διατηρούν κατ’ ανάγκην την ικανότητα αναπαραγωγής. Η βιβλιογραφία της ζυθοποιίας περιγράφει την ίδια έλλειψη αξιοπιστίας όταν η βιωσιμότητα έχει μειωθεί σημαντικά. Αντιμετωπίστε το κυανό του μεθυλενίου ως μια γρήγορη, κατά προσέγγιση εκτίμηση και επιβεβαιώστε κρίσιμες αποφάσεις σε περιπτώσεις χαμηλής βιωσιμότητας, όπως η επαναχρησιμοποίηση μιας καλλιέργειας για εμβολιασμό, με καταμέτρηση αποικιών σε τρυβλία ή με συμπληρωματική χρώση.

Τρίτες έρχονται οι επιδράσεις της μήτρας του δείγματος. Η μέθοδος του OIV εκτελείται κοντά σε pH 4.6 και προειδοποιεί ότι δείγματα χαμηλού pH με ισχυρή ρυθμιστική ικανότητα εμποδίζουν τη σωστή συμπεριφορά της χρωστικής. Παράλληλα, συνιστά να μην εφαρμόζεται η δοκιμασία όταν η συγκέντρωση σακχάρων υπερβαίνει τα 100 g/L, επειδή τα κύτταρα εμφανίζονται παραπλανητικά γαλάζια. Μια πειραματική σύγκριση του pH χρώσης διαπίστωσε σημαντικές μεταβολές στην ευαισθησία σε όλο το εύρος που εξετάστηκε, σε συμφωνία με μια μελέτη της εξάρτησης της μεθόδου με κυανό του μεθυλενίου από το pH. Τα υπολείμματα αποτελούν ξεχωριστή παγίδα: τα χρωματισμένα σωματίδια σε ακάθαρτους πολτούς μιμούνται νεκρά κύτταρα και αυξάνουν τη μεταβλητότητα μεταξύ χειριστών.

Αυτή η μεταβλητότητα έχει ποσοτικοποιηθεί και δεν βασίζεται απλώς σε μεμονωμένες παρατηρήσεις. Σε μια εξάμηνη δοκιμή ζυθοποιίας που αναφέρεται στη σύγκριση ζυμομυκήτων του FEMS, οι μετρήσεις με κυανό του μεθυλενίου σε διπλή επανάληψη είχαν κατά μέσο όρο τυπική απόκλιση 6.1%, έναντι 0.2% για την κυτταρομετρία ροής με οξονόλη, ενώ δύο χειριστές διέφεραν έως και 13 ποσοστιαίες μονάδες στο ίδιο δείγμα. Μια ποσοτική σύγκριση μεθόδων βιωσιμότητας του 2023 διαπίστωσε ότι η μικροσκοπία φθορισμού και η κυτταρομετρία ροής είχαν σημαντικά μεγαλύτερη ακρίβεια, δείχνοντας παράλληλα ότι η απόδοση εξαρτάται από το είδος και τη μήτρα του δείγματος. Η κλασική περιγραφή της μεθόδου από τους Painting και Kirsop (PMID 24430080) παραμένει το σημείο αναφοράς, ενώ μια ευρύτερη ανασκόπηση δοκιμασιών βιωσιμότητας και ζωτικότητας ζυμομυκήτων (PMID 25154541) κατατάσσει το κυανό του μεθυλενίου στις συμπληρωματικές και όχι στις οριστικές δοκιμές. Το κυανό του τρυπανίου δεν αποτελεί αυτονόητη αναβάθμιση εδώ: καταδεικνύει την απώλεια ακεραιότητας της μεμβράνης, ενώ το κυανό του μεθυλενίου καταδεικνύει την πρόσληψη της χρωστικής μαζί με την αναγωγική δραστηριότητα. Έτσι, τα κύτταρα που βρίσκονται υπό καταπόνηση μπορούν να ταξινομηθούν διαφορετικά με τις δύο χρωστικές.

Το πείραμα αναπνοής: χρονομετρήστε την εξαφάνιση του μπλε χρώματος

Η δεύτερη δοκιμασία δεν χρησιμοποιεί καθόλου μικροσκόπιο. Ζυμομύκητες, γλυκόζη και αραιό κυανό του μεθυλενίου τοποθετούνται σε κλειστό σωλήνα και το χρονόμετρο μετρά πόσο χρόνο χρειάζεται το μπλε χρώμα για να εξαφανιστεί. Καθώς τα κύτταρα μεταβολίζουν, παράγουν αναγωγικά ισοδύναμα που μετατρέπουν την μπλε χρωστική στην άχρωμη μορφή της, ενώ το διαλυμένο οξυγόνο την επανοξειδώνει. Μόλις τα κύτταρα μειώσουν το διαθέσιμο οξυγόνο, η αναγωγή υπερισχύει συνολικά και ο σωλήνας αποχρωματίζεται. Επομένως, το τελικό σημείο αντανακλά την ισορροπία μεταξύ αναπνοής, συγκέντρωσης χρωστικής και διαθεσιμότητας οξυγόνου. Πρέπει να αναφέρεται ως χρόνος αναγωγής ή αποχρωματισμού του κυανού του μεθυλενίου και όχι ως άμεσος ρυθμός κατανάλωσης μοριακού οξυγόνου.

Χρησιμοποιήστε πολύ πιο αραιή χρωστική από ό,τι στην καταμέτρηση βιωσιμότητας, ώστε ο χρόνος να βρίσκεται σε ένα πρακτικό εύρος. Το εγχειρίδιο υποχρεωτικών πρακτικών ασκήσεων A level του AQA το τυποποιεί καλά: 1 g γλυκόζης ανά 100 mL νερού θερμασμένου περίπου στους 30 C, προσθήκη 5 g ξηρών ζυμομυκήτων αμέσως πριν από τη χρήση και διάλυμα εργασίας χρωστικής περίπου 0.001%, παρασκευασμένο με αραίωση 0.1 mL αρχικού διαλύματος 1% μέχρι τελικό όγκο 100 mL. Αναμείξτε 2 mL εναιωρήματος ζυμομυκήτων και γλυκόζης με 2 mL διαλύματος εργασίας χρωστικής, αφήστε το μείγμα να εξισορροπηθεί στη θερμοκρασία της δοκιμής, ανακινήστε μία φορά για 10 δευτερόλεπτα, ξεκινήστε το χρονόμετρο και μην ανακινήσετε ξανά. Η ανακίνηση επανεισάγει οξυγόνο και επαναφέρει το μπλε χρώμα στον σωλήνα, προκαλώντας τη σημαντικότερη τεχνητή επίδραση της διαδικασίας. Το AQA σημειώνει ότι το παρασκεύασμα κανονικά αποχρωματίζεται μέσα σε περίπου 5 λεπτά στους 35 C, με μέσους χρόνους δοκιμών 275 s στους 20 C, 128 s στους 35 C και 145 s στους 45 C. Αυτά είναι παραδείγματα από μία συγκεκριμένη πειραματική διάταξη και όχι καθολικές τιμές αναφοράς. Η ποσοτική σχέση μεταξύ ρυθμού αναγωγής και μεταβολικά ενεργών ζυμομυκήτων υπό ελεγχόμενες συνθήκες υποστηρίζεται από ειδικές μελέτες αναγωγής, μεταξύ των οποίων η εργασία με αναγνωριστικό PMID 25773544 και η μελέτη του μηχανισμού στο Yeast (2014).

Παράδειγμα χρονικής εξέλιξης (πρωτότυπο υλικό)

Ο παρακάτω πίνακας είναι ένα πρωτότυπο παράδειγμα που δημιουργήθηκε για αυτό το άρθρο με τη διάταξη τύπου AQA που περιγράφεται παραπάνω: 2 mL μείγματος ζυμομυκήτων και γλυκόζης μαζί με 2 mL διαλύματος εργασίας χρωστικής περίπου 0.001%, μία ανακίνηση διάρκειας 10 δευτερολέπτων και στη συνέχεια επώαση χωρίς διατάραξη. Οι καταχωρίσεις είναι ενδεικτικές μετρήσεις στη μορφή που πρέπει να καταγράφει μια ομάδα μαθητών, με τον δείκτη ρυθμού να ορίζεται ως 1 διά του χρόνου αποχρωματισμού σε δευτερόλεπτα. Εκτελέστε το πείραμα με τους ίδιους σωλήνες και αντικαταστήστε αυτές τις καταχωρίσεις με μετρημένες τιμές.

Σχεδιάστε τον δείκτη ρυθμού ως προς τη θερμοκρασία για τους σωλήνες A, B και C. Η καμπύλη ανεβαίνει και στη συνέχεια σταθεροποιείται ή πέφτει, δηλαδή ακολουθεί το αναμενόμενο πρότυπο μιας διεργασίας που καθορίζεται από ένζυμα και όχι μια ευθεία γραμμή. Οι σωλήνες D, E και F δεν είναι σημεία δεδομένων αυτής της καμπύλης. Είναι οι μάρτυρες που καθιστούν δυνατή την ερμηνεία της.

Μάρτυρες που δίνουν νόημα σε κάθε δοκιμασία

Κάθε πείραμα αναπνοής χρειάζεται τρεις συνοδευτικούς μάρτυρες. Βρασμένοι ή θανατωμένοι ζυμομύκητες μαζί με γλυκόζη και χρωστική πρέπει να παραμένουν μπλε, αποδεικνύοντας ότι η γρήγορη αναγωγή εξαρτάται από τον μεταβολισμό ζωντανών κυττάρων. Ζωντανοί ζυμομύκητες με χρωστική, χωρίς προσθήκη γλυκόζης, αποτελούν μάρτυρα υποστρώματος· ωστόσο, αναμένεται και πάλι αργός αποχρωματισμός, επειδή οι ζυμομύκητες καταναλώνουν ενδογενή αποθέματα. Η γλυκόζη με χρωστική, χωρίς ζυμομύκητες, είναι το χημικό τυφλό δείγμα, απαραίτητο επειδή η γλυκόζη σε αλκαλικές συνθήκες μπορεί να ανάγει το κυανό του μεθυλενίου χωρίς την παρουσία κυττάρων.

Η καταμέτρηση βιωσιμότητας χρειάζεται διαφορετικό είδος ελέγχου: σταθερότητα της διαδικασίας. Ίδιο αρχικό διάλυμα χρωστικής, ίδια αναλογία ανάμειξης, ίδιος χρόνος χρώσης, ίδια περιοχή θαλάμου, ίδιοι κανόνες για εκβλαστήματα και όρια, με τυφλή καταμέτρηση όπου είναι δυνατόν. Όταν δύο χειριστές διαφωνούν κατά δέκα ποσοστιαίες μονάδες, το φύλλο εργασίας συνήθως αποκαλύπτει την αιτία: διαφορετικός χρόνος, διαφορετικό όριο έντασης του μπλε ή διαφορετικοί κανόνες για τα εκβλαστήματα. Οι τεχνικές προετοιμασίας και παρατήρησης χρωματισμένων κυττάρων συνδέονται με τις μεθόδους απλής χρώσης βακτηρίων, ενώ μια ευρύτερη επισκόπηση του τι επισημαίνει η χρωστική σε διαφορετικά δείγματα βρίσκεται στον άτλαντα μικροσκοπικών χρώσεων. Για τη φυσική πίσω από την ποσοτική ανάγνωση οποιασδήποτε έντασης μπλε, η αναφορά απορρόφησης με αναγραφόμενες συνθήκες εξηγεί γιατί κάθε συντελεστής πρέπει να συνοδεύεται από τις συνθήκες διαλύτη, pH και συγκέντρωσης.

Επιλέξτε τη δοκιμασία με βάση το ερώτημα. Το πόσα κύτταρα είναι ζωντανά αυτή τη στιγμή είναι ερώτημα καταμέτρησης, που απαντάται στο μικροσκόπιο με ένα φύλλο εργασίας. Το πόσο ενεργά αναπνέει αυτή η καλλιέργεια είναι ερώτημα κινητικής, που απαντάται με χρονόμετρο και σωλήνες υπό ελεγχόμενες συνθήκες. Το κυανό του μεθυλενίου εξυπηρετεί και τα δύο, αλλά ποτέ στον ίδιο σωλήνα την ίδια στιγμή.