Ερμηνεία της εμφάνισης αποικιών E. coli και άλλων μικροοργανισμών σε άγαρ EMB

Ένας φοιτητής ενοφθαλμίζει ένα άγνωστο δείγμα με γραμμώσεις σε άγαρ ηωσίνης–κυανού του μεθυλενίου, το επωάζει όλη τη νύχτα και επιστρέφει σε ένα τρυβλίο με σκούρες αποικίες που λαμπυρίζουν πράσινες. Η καταχώριση στο τετράδιο γράφει «E. coli, επιβεβαιωμένο». Αυτή η καταχώριση ισχυρίζεται περισσότερα από όσα μπορεί να τεκμηριώσει το τρυβλίο. Το τρυβλίο δείχνει έναν φαινότυπο ανάπτυξης και ζύμωσης υπό συγκεκριμένες συνθήκες. Η ταυτότητα του είδους αποτελεί ξεχωριστό συμπέρασμα που χρειάζεται ξεχωριστά τεκμήρια.

Αυτός ο οδηγός προσεγγίζει τα αποτελέσματα του άγαρ EMB ως άσκηση ερμηνείας. Εξηγεί τη βασική αρχή, παρουσιάζει έναν ενδεικτικό άτλαντα τρυβλίων με μάρτυρες και επισημαίνει τις περιπτώσεις όπου η εικόνα των εγχειριδίων παραπλανά.

Η αρχή πίσω από το τρυβλίο

Το άγαρ EMB είναι ταυτόχρονα εκλεκτικό και διαφοροποιητικό. Οι χρωστικές ηωσίνη Y και κυανό του μεθυλενίου καταστέλλουν πολλούς θετικούς κατά Gram μικροοργανισμούς, οπότε το μέσο ευνοεί την ανάπτυξη αρνητικών κατά Gram μικροοργανισμών. Οι ίδιες χρωστικές λειτουργούν ως δείκτες: όταν ένας μικροοργανισμός ζυμώνει το διαθέσιμο σάκχαρο και παράγει αρκετό οξύ τοπικά, η αποικία προσλαμβάνει έντονα τη χρωστική και γίνεται σκούρα μωβ έως κυανόμαυρη. Με έντονη παραγωγή οξέος, η επιφάνεια της αποικίας μπορεί να εμφανίσει έναν μεταλλικό πράσινο ιριδισμό. Το πρωτόκολλο της ASM για τρυβλία άγαρ ηωσίνης–κυανού του μεθυλενίου περιγράφει αυτόν τον συνδυασμό εκλεκτικότητας και διαφοροποίησης και παρέχει φωτογραφίες αναφοράς για διδασκαλία.

Μια λεπτομέρεια έχει σημασία πριν από την ερμηνεία οποιουδήποτε αποτελέσματος: ελέγξτε ποια σύνθεση χρησιμοποιείται. Η παλαιότερη σύνθεση Holt Harris Teague περιέχει λακτόζη και σακχαρόζη, ενώ το EMB κατά Levine περιέχει μόνο λακτόζη. Ένας μικροοργανισμός που ζυμώνει τη σακχαρόζη αλλά όχι τη λακτόζη, όπως πολλά απομονωμένα στελέχη Serratia marcescens, μπορεί να έχει διαφορετική εμφάνιση στις δύο εκδοχές. Η τεκμηρίωση του κατασκευαστή για τα μέσα EMB αναφέρει ρητά αυτή τη διαφορά σύνθεσης. Καταγράψτε στο τετράδιο τον κατασκευαστή και τη σύνθεση μαζί με το αποτέλεσμα.

Το παρασκευασμένο, μη ενοφθαλμισμένο άγαρ EMB είναι συνήθως καστανοκόκκινο έως ερυθροϊώδες, μερικές φορές με πρασινωπή απόχρωση ή λεπτό ίζημα. Αυτό το χρώμα του υποβάθρου δεν αποτελεί ανάπτυξη. Συγκρίνετε κάθε παρατήρηση με ένα μη ενοφθαλμισμένο τρυβλίο ή με την τεκμηριωμένη αρχική εικόνα και αξιολογήστε το τρυβλίο της πρωτογενούς καλλιέργειας μετά από περίπου 18 έως 24 ώρες αερόβιας επώασης στους 35 έως 37 C, εκτός αν το εκπαιδευτικό πρωτόκολλο ορίζει διαφορετικά. Η παρατεταμένη επώαση μπορεί να αλλάξει την εικόνα της ζύμωσης.

Πώς να εξετάζετε το τρυβλίο

Χρησιμοποιήστε δύο είδη φωτισμού. Αρχικά εξετάστε το τρυβλίο με ανακλώμενο ή πλάγιο φως και γείρετέ το: η μεταλλική λάμψη είναι ιριδίζουσα και μπορεί να εμφανίζεται ή να εξαφανίζεται ανάλογα με τη γωνία παρατήρησης. Έπειτα εξετάστε το με διερχόμενο φως για να αξιολογήσετε το χρώμα των αποικιών και τα σκούρα κέντρα τους. Βασιστείτε σε καλά απομονωμένες αποικίες, καθώς η πυκνή ανάπτυξη και οι γειτονικές αποικίες μεταβάλλουν την τοπική συσσώρευση οξέος και μπορούν να εξασθενήσουν ή να εντείνουν το χρώμα. Η συλλογή εικόνων της ASM το δείχνει άμεσα: το E. coli σε μικτή καλλιέργεια μπορεί να χάσει την αναμενόμενη λάμψη του, επειδή οι γύρω μικροοργανισμοί μεταβάλλουν το όξινο περιβάλλον.

Συμπεριλάβετε μάρτυρες όποτε το επιτρέπει η άσκηση. Ένα συνηθισμένο εκπαιδευτικό σύνολο περιλαμβάνει E. coli ATCC 25922 για τον φαινότυπο κυανόμαυρου χρώματος και μεταλλικής λάμψης, έναν μη ζυμωτικό μικροοργανισμό όπως Salmonella Typhimurium ATCC 14028 ή Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 για τον άχρωμο φαινότυπο και έναν θετικό κατά Gram μικροοργανισμό όπως Enterococcus faecalis ή Staphylococcus aureus ως μάρτυρα αναστολής, όπως αναφέρονται στους τυπικούς πίνακες ποιοτικού ελέγχου για μέσα EMB. Αν ο θετικός μάρτυρας δεν εμφανίζει λάμψη, εξετάστε πρώτα την επώαση, την πυκνή ανάπτυξη ή τη σύνθεση του μέσου πριν αμφισβητήσετε το άγνωστο δείγμα.

Ενδεικτικός άτλας τρυβλίων

Τα παρακάτω τρυβλία είναι δημιουργημένες απεικονίσεις, όχι φωτογραφίες πραγματικών καλλιεργειών. Δείχνουν το μοτίβο που πρέπει να αναζητάτε, όχι την ακριβή απόχρωση κάποιου συγκεκριμένου στελέχους. Συγκρίνετέ τα με τις φωτογραφίες αναφοράς της ASM και με πραγματικά τρυβλία του εκπαιδευτικού εργαστηρίου.

Τρυβλίο 1: Escherichia coli σε άγαρ EMB, έντονη ζύμωση λακτόζης

Το E. coli σε άγαρ EMB είναι συνήθως σκούρο μωβ έως κυανόμαυρο, συχνά με σκούρο κέντρο και μεταλλική πράσινη λάμψη λόγω έντονης παραγωγής οξέος. Η λάμψη είναι το γνωστό εύρημα που αναζητούν οι φοιτητές, αλλά πρέπει να αντιμετωπίζεται ως υποστηρικτικό στοιχείο και όχι ως οριστικό κριτήριο. Η ένταση της λάμψης ποικίλλει ανάλογα με το στέλεχος, τον χρόνο επώασης, την πυκνότητα των αποικιών και τη γωνία παρατήρησης. Η απουσία λάμψης δεν αποκλείει το E. coli, ενώ μια σκούρα αποικία χωρίς λάμψη παραπέμπει σε διάφορους άλλους μικροοργανισμούς που ζυμώνουν σάκχαρα. Επιλέξτε μια καλά απομονωμένη αποικία για οποιαδήποτε περαιτέρω εργασία, αντί να βασίζετε την ερμηνεία σε έναν τομέα με πυκνή ανάπτυξη.

Τρυβλίο 2: Klebsiella pneumoniae σε άγαρ EMB, βλεννώδεις αποικίες μικροοργανισμού που ζυμώνει σάκχαρα

Η Klebsiella pneumoniae σε άγαρ EMB σχηματίζει συνήθως μεγάλες, γυαλιστερές, βλεννώδεις αποικίες σε ροζ-μωβ έως καστανοϊώδεις αποχρώσεις, συχνά με σκούρα κέντρα αλλά συνήθως χωρίς έντονη μεταλλική λάμψη. Παρόμοια μορφολογία εμφανίζουν συγγενικοί μικροοργανισμοί που ζυμώνουν σάκχαρα, όπως το Enterobacter. Η βλεννώδης υφή και το μέγεθος της αποικίας αποτελούν μέρος της αξιολόγησης: μια μικρή και επίπεδη ροζ αποικία έχει διαφορετική ερμηνευτική βαρύτητα από μια μεγάλη, θολωτή, βλεννώδη αποικία. Όπως και με το E. coli, το τρυβλίο υποδεικνύει έναν φαινότυπο ζύμωσης, ενώ η ταυτοποίηση σε επίπεδο είδους χρειάζεται τη βιοχημική επιβεβαίωση που περιγράφεται παρακάτω.

Τρυβλίο 3: Salmonella σε άγαρ EMB και άλλοι μη ζυμωτικοί μικροοργανισμοί, άχρωμες αποικίες

Η Salmonella σε άγαρ EMB και άλλοι συγγενικοί μικροοργανισμοί που δεν ζυμώνουν λακτόζη, συμπεριλαμβανομένων της Shigella και πολλών απομονωμένων στελεχών Pseudomonas, αναπτύσσονται συνήθως ως άχρωμες έως ημιδιαφανείς ή ανοιχτόχρωμες κεχριμπαρένιες αποικίες. Ορισμένες συνθέσεις και συνθήκες δίνουν μια αχνή ροζ απόχρωση, επομένως μια απαλή ροζ αποικία δεν ανήκει αυτομάτως σε μικροοργανισμό που ζυμώνει σάκχαρα. Το EMB δεν διακρίνει τη Salmonella από τη Shigella ή από άλλους μη ζυμωτικούς μικροοργανισμούς· αυτή η διάκριση γίνεται με επόμενες δοκιμές. Σημειώστε επίσης ότι έχουν τεκμηριωθεί στελέχη Salmonella που ζυμώνουν λακτόζη και σχηματίζουν μεταλλικές αποικίες παρόμοιες με του E. coli, ένας ακόμη λόγος για τον οποίο ένα μόνο τρυβλίο δεν αρκεί για οριστικό συμπέρασμα.

Τρυβλίο 4: Serratia marcescens και η παγίδα της σύνθεσης

Η Serratia marcescens χρειάζεται ξεχωριστή ενότητα, επειδή οι φοιτητές συχνά περιμένουν κόκκινες αποικίες και στη συνέχεια ερμηνεύουν λανθασμένα το τρυβλίο. Τα περισσότερα κλινικά απομονωμένα στελέχη δεν ζυμώνουν λακτόζη, οπότε στο EMB κατά Levine εμφανίζονται συνήθως ωχρά έως ασθενώς χρωματισμένα. Επειδή πολλά απομονωμένα στελέχη ζυμώνουν σακχαρόζη, μια σύνθεση που περιέχει σακχαρόζη μπορεί να δώσει πιο σκούρα αντίδραση ή αντίδραση που συνδέεται με εντονότερη παραγωγή οξέος. Μην περιμένετε ούτε την κλασική κόκκινη χρωστική προδιγιοσίνη στους 35 έως 37 C· η παραγωγή της χρωστικής δεν είναι αξιόπιστη στη θερμοκρασία επώασης. Όταν το πρωτόκολλο αναφέρεται στη Serratia marcescens σε άγαρ EMB, ελέγξτε ποια σύνθεση προϋποθέτει η αναφορά. Μια ανασκόπηση του μεταβολισμού της Serratia συνοψίζει το πρότυπο αρνητικής ζύμωσης λακτόζης και μεταβλητής ζύμωσης σακχαρόζης που βρίσκεται πίσω από αυτή την παγίδα.

Τρυβλίο 5: μάρτυρες και μικροοργανισμοί των οποίων η ανάπτυξη αναστέλλεται

Οι θετικοί κατά Gram μικροοργανισμοί, όπως οι Staphylococcus, Enterococcus, Streptococcus και Bacillus, γενικά αναστέλλονται ή η ανάπτυξή τους καταστέλλεται σημαντικά σε άγαρ EMB, αν και η αναστολή δεν είναι απόλυτη για κάθε στέλεχος. Ένα σύνολο μαρτύρων εξασφαλίζει τεκμηριωμένη αξιολόγηση: ο μάρτυρας E. coli πρέπει να εμφανίζει καλή ανάπτυξη με κυανόμαυρο χρώμα και λάμψη, ο μάρτυρας μη ζυμωτικού μικροοργανισμού πρέπει να εμφανίζει άχρωμη ανάπτυξη και ο μάρτυρας αναστολής πρέπει να εμφανίζει ελάχιστη ή καθόλου ανάπτυξη. Αν ο μάρτυρας αναστολής αναπτύσσεται καλά, η εκλεκτική λειτουργία έχει αποτύχει και κάθε άλλη αξιολόγηση της συγκεκριμένης παρτίδας είναι αμφίβολη. Οι μέθοδοι χρώσης απαντούν σε διαφορετικό ερώτημα από τα καλλιεργητικά μέσα· για τη χρώση παρασκευασμάτων σε αντικειμενοφόρες πλάκες, δείτε τον άτλαντα χρώσης με κυανό του μεθυλενίου.

Σύγκριση με σαφή όρια

Τρεις προτάσεις συνοψίζουν τις παραπλανητικές εμφανίσεις. Το σκούρο χρώμα δεν σημαίνει E. coli, καθώς η Klebsiella, το Enterobacter και άλλοι μικροοργανισμοί που ζυμώνουν σάκχαρα αναπτύσσουν σκούρα κέντρα χωρίς λάμψη. Το ροζ χρώμα δεν σημαίνει Klebsiella, καθώς μικροοργανισμοί με μέτρια ή αργή ζύμωση και ορισμένοι που κατατάσσονται ως μη ζυμωτικοί εμφανίζονται ροζ ή ανοιχτοϊώδεις. Η λάμψη δεν σημαίνει οριστική ταυτοποίηση E. coli, καθώς και άλλοι μικροοργανισμοί με έντονη ζύμωση μπορούν να την παράγουν. Το εκπαιδευτικό πρωτόκολλο και οι εικόνες μικτών καλλιεργειών του δείχνουν καθεμία από αυτές τις περιπτώσεις όπου η ερμηνεία αποτυγχάνει.

Όρια επιβεβαίωσης

Το άγαρ EMB δείχνει έναν φαινότυπο, όχι ένα είδος. Διαφορετικοί μικροοργανισμοί μπορούν να έχουν την ίδια εμφάνιση αποικιών, ενώ ένας μικροοργανισμός μπορεί να αποκλίνει από την εικόνα των εγχειριδίων ανάλογα με το στέλεχος, την ηλικία της καλλιέργειας, την πυκνή ανάπτυξη, τη σύνθεση και την επώαση. Γι’ αυτό οι εκπαιδευτικές και κλινικές διαδικασίες αντιμετωπίζουν τη μορφολογία στο EMB ως προκαταρκτική ένδειξη.

Μια τεκμηριωμένη διαδικασία για τον φοιτητή είναι η εξής: περιγράψτε την απομονωμένη αποικία (μέγεθος, χρώμα, κέντρο, λάμψη σε πλάγιο φως, βλεννώδη χαρακτήρα), καταγράψτε τη σύνθεση, τον χρόνο και τη θερμοκρασία επώασης και τους μάρτυρες· έπειτα ανακαλλιεργήστε μια καλά απομονωμένη αποικία για να αποκτήσετε καθαρή καλλιέργεια πριν από οποιαδήποτε επιβεβαιωτική δοκιμή. Συνήθεις επόμενοι έλεγχοι περιλαμβάνουν χρώση Gram μαζί με αντιδράσεις IMViC για την προκαταρκτική ταυτοποίηση E. coli και κολοβακτηριοειδών, TSI ή KIA και σειρές βιοχημικών δοκιμών ειδικές για τον μικροοργανισμό για τα εντερικά βακτήρια, με ορολογική ταυτοποίηση, MALDI TOF ή άλλη επικυρωμένη μέθοδο ταυτοποίησης όπου το απαιτεί η εργασία. Για το πώς εντάσσεται το EMB στα εκλεκτικά και διαφοροποιητικά μέσα για εντερικά βακτήρια, δείτε εισαγωγικά κείμενα για αυτά τα καλλιεργητικά μέσα και τους επόμενους ελέγχους με χρώση Gram. Για το συναφές ερώτημα του τι μπορεί και τι δεν μπορεί να αποδείξει μια μπλε χρώση σε αντικειμενοφόρο πλάκα, ο άτλαντας χρώσης με κυανό του μεθυλενίου διαχωρίζει την παρατήρηση από το συμπέρασμα με το ίδιο σκεπτικό.

Καταγράψτε την παρατήρηση πριν από το συμπέρασμα. Η διατύπωση «Σκούρες κυανόμαυρες αποικίες με πράσινη λάμψη που εξαρτάται από τη γωνία παρατήρησης σε EMB κατά Levine στις 24 ώρες, συμβατές με έντονη ζύμωση λακτόζης» είναι τεκμηριωμένη. Η διατύπωση «E. coli, επιβεβαιωμένο» απαιτεί το βήμα επιβεβαίωσης που το τρυβλίο από μόνο του δεν μπορεί να προσφέρει.