Δοκιμή αναγωγής του κυανού του μεθυλενίου στο γάλα

Μια φοιτήτρια σηκώνει δύο σωλήνες με γάλα. Ο ένας έγινε λευκός μέσα σε μία ώρα. Ο άλλος παρέμεινε μπλε για πέντε ώρες. Δείχνει τον μπλε και λέει ότι είναι ασφαλές να το πιει.

Αυτό το συμπέρασμα φανερώνει μια λανθασμένη αντίληψη. Η δοκιμή γάλακτος με κυανό του μεθυλενίου δεν ανιχνεύει την ασφάλεια. Δείχνει πόσο γρήγορα ο μικροβιακός πληθυσμός στον συγκεκριμένο σωλήνα μειώνει το οξειδοαναγωγικό δυναμικό υπό σταθερές συνθήκες. Ένα αργό αποτέλεσμα σημαίνει χαμηλή συνολική μεταβολική δραστηριότητα στο δείγμα. Δεν λέει τίποτα για το ποιοι οργανισμοί υπάρχουν, αν ανάμεσά τους βρίσκεται κάποιο παθογόνο ή αν το γάλα παστεριώθηκε σωστά.

Η διάκριση έχει σημασία επειδή η δοκιμή φαίνεται πειστική. Το μπλε εξαφανίζεται. Ένα χρονόμετρο δίνει έναν αριθμό. Οι αριθμοί ευνοούν την υπερερμηνεία. Αυτό το άρθρο διατηρεί τη χρήσιμη ερμηνεία και αποκλείει την επικίνδυνη.

Τι μετρά πραγματικά η αναγωγή

Το κυανό του μεθυλενίου είναι μπλε όταν είναι οξειδωμένο και σχεδόν άχρωμο όταν ανάγεται σε λευκοκυανό του μεθυλενίου. Το φρέσκο γάλα περιέχει διαλυμένο οξυγόνο, το οποίο διατηρεί τη χρωστική μπλε. Τα βακτήρια που αναπνέουν και πραγματοποιούν ζύμωση καταναλώνουν αυτό το οξυγόνο και απελευθερώνουν αναγωγικές ενώσεις. Όταν το οξειδοαναγωγικό δυναμικό μειωθεί αρκετά, η χρωστική δέχεται ηλεκτρόνια και χάνει το χρώμα της. Το εκπαιδευτικό κείμενο μικροβιολογίας γαλακτοκομικών του Πανεπιστημίου του Guelph περιγράφει την ίδια αλληλουχία ως απομάκρυνση του οξυγόνου, ακολουθούμενη από σχηματισμό αναγωγικών ουσιών κατά τον βακτηριακό μεταβολισμό.

Κλασική εργασία στο Journal of Dairy Science την περιγράφει ως διαδικασία δύο σταδίων: η μικροχλωρίδα εξαντλεί πρώτα το οξυγόνο και στη συνέχεια τα συστατικά του γάλακτος ανάγουν γρήγορα τη χρωστική. Επομένως, η δοκιμή αναγωγής του κυανού του μεθυλενίου στο γάλα γίνεται καλύτερα κατανοητή ως λειτουργική δοκιμασία της συνδυασμένης μεταβολικής δραστηριότητας, όχι ως μέτρηση του αριθμού των κυττάρων. Η οξειδοαναγωγική συμπεριφορά του κυανού του μεθυλενίου εξηγεί τη χημεία πίσω από αυτή τη μεταβολή.

Το οξυγόνο αναστρέφει την κατάσταση στο τελικό σημείο. Η ανηγμένη λευκομορφή της χρωστικής, όταν εκτεθεί στον αέρα, επανοξειδώνεται και γίνεται ξανά μπλε. Επομένως, η ανακίνηση, η μετάγγιση, οι πλατιοί σωλήνες και ο μεγάλος κενός χώρος πάνω από το υγρό καθυστερούν το αποτέλεσμα. Ένας λεπτός μπλε δακτύλιος συχνά παραμένει στην επιφάνεια επαφής με τον αέρα, αφού ο κύριος όγκος του περιεχομένου έχει αποχρωματιστεί. Οι τυποποιημένες διαδικασίες αποδέχονται αυτόν τον δακτύλιο αντί να περιμένουν να εξαφανιστεί.

Ο τύπος των οργανισμών προσθέτει μια δεύτερη στρέβλωση. Τα κολοβακτηριοειδή και πολλοί γαλακτικοί μικροοργανισμοί ανάγουν γρήγορα τη χρωστική. Πολλοί ψυχρότροφοι και θερμοάντοχοι οργανισμοί την ανάγουν αργά ή σχεδόν καθόλου. Δύο δείγματα γάλακτος με την ίδια καταμέτρηση σε τρυβλίο μπορεί να χάσουν το μπλε χρώμα με διαφορά ωρών. Αυτό το γεγονός από μόνο του αποκλείει τη μετατροπή του χρόνου σε αριθμό αποικιών.

Μια ελεγχόμενη εργαστηριακή διαδικασία

Οι εκδοχές για χρήση στο πεδίο και εκείνες των εγχειριδίων διαφέρουν στις λεπτομέρειες, οπότε ένα αποτέλεσμα είναι έγκυρο μόνο στο πλαίσιο της μεθόδου που το παρήγαγε. Μια συμβατική εκδοχή για εργαστήριο τροφίμων εκτελείται ως εξής:

Συλλέξτε νωπό γάλα με ελάχιστο αερισμό και ψύξτε το αμέσως. Αναμείξτε με ήπια αναστροφή πριν από τη δειγματοληψία.
Μεταφέρετε 10 mL γάλακτος σε αποστειρωμένο σωλήνα με 1 mL διαλύματος εργασίας της χρωστικής. Μια ευρέως χρησιμοποιούμενη συγκέντρωση εργασίας είναι 0.005 τοις εκατό χρωστικής, με αναλογία γάλακτος προς χρωστική 10 προς 1.
Πωματίστε τον σωλήνα, αναστρέψτε τον ήπια δύο φορές και τοποθετήστε τον σε υδατόλουτρο μέσα σε λίγα λεπτά. Η συνήθης επώαση γίνεται στους 35 έως 38 βαθμούς Κελσίου, ανάλογα με το συγκεκριμένο πρότυπο. Καταγράψτε ποιο ακολουθείτε.
Προστατεύστε τους σωλήνες από το φως κατά την επώαση, καθώς το φως επιταχύνει την αναγωγή.
Κάντε την πρώτη ανάγνωση στα 30 λεπτά και στη συνέχεια σε σταθερά διαστήματα. Το τελικό σημείο είναι ο χρόνος κατά τον οποίο ο σωλήνας αντιστοιχεί σε δείγμα αναφοράς βρασμένου γάλακτος ή φτάνει στον αποχρωματισμό που ορίζει η διαδικασία.
Διατηρήστε έναν σωλήνα χωρίς προσθήκη χρωστικής από το ίδιο γάλα ως οπτικό μάρτυρα, όπου το απαιτεί η μέθοδος.

Το εγχειρίδιο ελέγχου γάλακτος του FAO δίνει μια σαφή εκδοχή αυτής της αλληλουχίας για χρήση στο πεδίο, με 10 mL γάλακτος και 1 mL χρωστικής, πωματισμό, ήπια αναστροφή, επώαση κοντά στους 37 έως 38 βαθμούς και αναγνώσεις κάθε 30 λεπτά. Οι σωλήνες μάρτυρα χρησιμοποιούν βρασμένο γάλα για να καταστρέψουν το φυσικό αναγωγικό σύστημα και να παρέχουν σημείο αναφοράς για τη χρωματική σύγκριση.

Σχηματικό διάγραμμα της ελεγχόμενης δοκιμής αναγωγής του κυανού του μεθυλενίου στο γάλα, από τη δειγματοληψία έως τη χρονομετρημένη ανάγνωση του τελικού σημείου

Το παραπάνω διάγραμμα οριοθετεί το πλαίσιο ελέγχου. Ίδιοι όγκοι, ίδια χρωστική, ίδια θερμοκρασία, ίδια ανάμειξη, ίδια προστασία από το φως, ίδιος κανόνας τελικού σημείου. Αν αλλάξει οποιοδήποτε από αυτά, αλλάζει και ο χρόνος. Γι’ αυτό οι οικιακές εκδοχές που χρησιμοποιούν αυθαίρετη συγκέντρωση χρωστικής δεν είναι συγκρίσιμες με τις εργαστηριακές κατηγορίες ποιότητας.

Τι δείχνει ο χρόνος αναγωγής

Μεγαλύτερος χρόνος σημαίνει χαμηλότερη συνολική δραστηριότητα υπό τις δηλωμένες συνθήκες. Μικρότερος χρόνος σημαίνει υψηλότερη συνολική δραστηριότητα. Οι εκπαιδευτικοί πίνακες γαλακτοκομίας αντιστοιχίζουν αυτούς τους χρόνους σε κατά προσέγγιση κατηγορίες ποιότητας, για παράδειγμα 5 ή περισσότερες ώρες ως πολύ καλή ποιότητα και λιγότερο από 30 λεπτά ως κακή ποιότητα σε ένα σύστημα που προέρχεται από το BIS.

Η διακύμανση είναι το βασικό δίδαγμα. Ένα αποτέλεσμα 5 ωρών δεν έχει καθολική κατηγορία ποιότητας. Ανήκει στη διαδικασία που το όρισε. Επομένως, η τεκμηριωμένη μορφή αναφοράς είναι:

MBRT ίσο με X ώρες με τη συγκεκριμένη μέθοδο, που αντιστοιχεί στην κατηγορία ποιότητας αυτής της μεθόδου.

Ποτέ δεν είναι MBRT ίσο με X μονάδες σχηματισμού αποικιών ανά mL. Οι οδηγίες που προέρχονται από το Standard Methods αναφέρουν ότι τα αποτελέσματα αναγωγής χρωστικής δεν πρέπει να αναφέρονται ως αριθμοί βακτηρίων. Η διαδικασία απλής χρώσης με κυανό του μεθυλενίου απαντά επίσης σε διαφορετικό ερώτημα, καθώς δείχνει το σχήμα των κυττάρων στο μικροσκόπιο και όχι τη συνολική δραστηριότητα σε έναν σωλήνα.

Πίνακας ερμηνείας και περιορισμών

Αυτός ο πίνακας αποτελεί την πρωτότυπη αναφορά του άρθρου. Διαβάστε ολόκληρη κάθε γραμμή. Κανένα κελί δεν στέκεται μόνο του.

Παρατήρηση ή ισχυρισμός	Τι δείχνει	Τι δεν μπορεί να αποδείξει	Κύριοι παράγοντες που επηρεάζουν το αποτέλεσμα
Γρήγορη απώλεια του μπλε χρώματος, σε λιγότερο από 2 ώρες σε ένα σύστημα για νωπό γάλα	Υψηλή αναγωγική δραστηριότητα, συμβατή με υψηλό μικροβιακό φορτίο ή χαμηλή διατηρησιμότητα	Είδη, ακριβή αριθμό, τοξίνες ή αποτυχία παστερίωσης	Αποθήκευση σε υψηλή θερμοκρασία, μικροχλωρίδα πλούσια σε κολοβακτηριοειδή, φως, μικρή ποσότητα χρωστικής
Ενδιάμεσος χρόνος, 2 έως 4 ώρες	Μέτρια δραστηριότητα· κατηγοριοποίηση μόνο στο πλαίσιο του συγκεκριμένου συστήματος	Ασφάλεια ή απουσία οργανισμών που ανάγουν αργά τη χρωστική	Υψηλή θερμοκρασία επώασης, διαφορές αερισμού, διαχωρισμός λίπους
Αργή αναγωγή, 5 ή περισσότερες ώρες	Χαμηλή συνολική δραστηριότητα στο συγκεκριμένο σύστημα	Απουσία παθογόνων, παστερίωση ή χημική ασφάλεια	Κατάλοιπα αντιβιοτικών, συντηρητικά, επιπλέον διαλυμένο οξυγόνο, μεγάλη ποσότητα χρωστικής
Ο μπλε δακτύλιος παραμένει στην επιφάνεια ενώ ο κύριος όγκος αποχρωματίζεται	Επανοξείδωση στη διεπιφάνεια με τον αέρα, ένα φυσιολογικό φαινόμενο στην επιφάνεια	Αποτυχία της δοκιμής ή ατελή αντίδραση	Πλατύς σωλήνας, χαλαρό πώμα, επανειλημμένο άνοιγμα για επιθεώρηση
Λευκός σωλήνας μετά την επώαση θερμασμένου γάλακτος	Τροποποιημένο αναγωγικό σύστημα μαζί με δραστηριότητα που επιβίωσε	Ότι η θέρμανση ισοδυναμούσε με επικυρωμένη παστερίωση	Θερμικός τραυματισμός, αποκατάσταση κατά την επώαση, μεταγενέστερη επιμόλυνση
Οποιαδήποτε μεμονωμένη τιμή MBRT αναφέρεται χωρίς μέθοδο	Άγνωστες συνθήκες δοκιμής	Οποιαδήποτε κατηγορία ποιότητας ή καταμέτρηση	Δεν αναφέρονται η σύνθεση της χρωστικής, η αναλογία, η θερμοκρασία, η ανάμειξη και ο κανόνας τελικού σημείου

Οι έλεγχοι που βασίζονται στην ανάπτυξη, όπως εκείνοι με θρεπτικά υλικά καλλιέργειας βακτηρίων, παραμένουν ο τρόπος για την καταμέτρηση και την απομόνωση. Ο σωλήνας αναγωγής παρέχει προκαταρκτικό έλεγχο. Το τρυβλίο ταυτοποιεί και μετρά.

Τι δεν μπορεί να αποδείξει η δοκιμή για την ασφάλεια

Ένα αργό αποτέλεσμα δεν μπορεί να αποδείξει την απουσία παθογόνων. Ένα παθογόνο που υπάρχει σε ποσότητα κλινικά σημαντική μπορεί να συμβάλλει ελάχιστα στη συνολική κατανάλωση οξυγόνου. Η ανίχνευση παθογόνων απαιτεί μεθόδους ειδικές για τον οργανισμό, τις οποίες το ισχύον Standard Methods αντιμετωπίζει ως ξεχωριστό πεδίο από τον γενικό προκαταρκτικό έλεγχο ποιότητας.

Δεν μπορεί να επαληθεύσει την παστερίωση. Η επαλήθευση της θερμικής επεξεργασίας χρησιμοποιεί δοκιμή αλκαλικής φωσφατάσης ή άλλη επικυρωμένη μέθοδο σύμφωνα με τις οδηγίες υγιεινής γαλακτοκομικών του Codex. Ένας λευκός ή μπλε σωλήνας δεν λέει τίποτα για το ιστορικό χρόνου και θερμοκρασίας της παρτίδας.

Δεν μπορεί να πιστοποιήσει την ασφάλεια του τροφίμου. Η ασφάλεια εξαρτάται από παθογόνα, ήδη σχηματισμένες τοξίνες, κατάλοιπα φαρμάκων, χημικούς επιμολυντές, το ιστορικό της ψυκτικής αλυσίδας και την επιμόλυνση μετά τη δειγματοληψία. Ο Codex αντιμετωπίζει την ασφάλεια των γαλακτοκομικών ως αλυσίδα μέτρων ελέγχου και όχι ως ένα αποτέλεσμα προκαταρκτικού ελέγχου.

Το πλαίσιο του εργαστηρίου τροφίμων δεν είναι οικιακή δοκιμή

Σε ένα εργαστήριο γαλακτοκομικών, η δοκιμή χρησιμοποιείται για προκαταρκτικό έλεγχο του γάλακτος κατά την παραλαβή, για σύγκριση προμηθευτών σε βάθος χρόνου ή για διδασκαλία της οξειδοαναγωγικής μικροβιολογίας υπό επίβλεψη. Τα δείγματα είναι ιχνηλάσιμα. Τα αντιδραστήρια είναι τυποποιημένα. Οι θερμοκρασίες καταγράφονται. Τα απόβλητα διατίθενται μέσω των διαδικασιών διαχείρισης εργαστηριακών αποβλήτων.

Οι οικιακές δοκιμές δεν διαθέτουν τίποτα από αυτά. Οι όγκοι στην κουζίνα είναι κατά προσέγγιση. Οι συγκεντρώσεις των χρωστικών που πωλούνται διαδικτυακά ποικίλλουν σημαντικά. Η επώαση συχνά γίνεται σε ένα ζεστό δωμάτιο αντί για βαθμονομημένο υδατόλουτρο. Η αλλαγή χρώματος εξακολουθεί να συμβαίνει, κάνοντας το αποτέλεσμα να φαίνεται αξιόπιστο, ενώ λείπουν όλοι οι έλεγχοι που του έδιναν νόημα.

Ο πιο άμεσος κίνδυνος αφορά τη συμπεριφορά. Ένας μπλε σωλήνας στο σπίτι ενθαρρύνει την κατανάλωση νωπού γάλακτος που ένα εργαστήριο θα εξακολουθούσε να στέλνει για καταμετρήσεις σε τρυβλίο, ελέγχους παθογόνων και ελέγχους καταλοίπων. Η δοκιμή γάλακτος με κυανό του μεθυλενίου σχεδιάστηκε για την κατάταξη του νωπού γάλακτος κατά την παραλαβή, όχι για να εγκρίνει το γάλα ως κατάλληλο για κατανάλωση. Ο ταχύτερος προκαταρκτικός έλεγχος με ρεσαζουρίνη έχει τον ίδιο περιορισμό: ταχύτερη ανάγνωση χρώματος, αλλά και πάλι καμία απάντηση για τα παθογόνα.

Ένας σύντομος κανόνας για τον εργαστηριακό πάγκο

Τυποποιήστε τη χρωστική, την αναλογία, τη θερμοκρασία, την ανάμειξη, το φως και το τελικό σημείο. Αναφέρετε τον χρόνο μαζί με την ονομασία της μεθόδου και την κατηγορία ποιότητας. Ερμηνεύστε τα λεπτά λαμβάνοντας υπόψη το ιστορικό αποθήκευσης, τον τύπο μικροχλωρίδας, τα κατάλοιπα και την ποιότητα της δειγματοληψίας. Ένας σύντομος χρόνος επισημαίνει δραστηριότητα που αξίζει να διερευνηθεί. Ένας μεγάλος χρόνος δεν πιστοποιεί ποτέ την ασφάλεια.