Άρθρο
Η δοκιμασία αναγωγής του κυανού του μεθυλενίου σε υγρό μεγάλης κοιλίας
Μια νέα απόφοιτη τηλεφωνεί από μια κτηνοτροφική μονάδα κρατώντας έναν δοκιμαστικό σωλήνα με μπλε περιεχόμενο. Πρόσθεσε κυανό του μεθυλενίου σε υγρό μεγάλης κοιλίας πριν από δέκα λεπτά και το μπλε χρώμα παραμένει. Ρωτά αν πρέπει να δώσει περισσότερη χρωστική στην αγελάδα.
Αυτή η ερώτηση αποκαλύπτει μια λανθασμένη αντίληψη. Στη δοκιμασία αναγωγής του κυανού του μεθυλενίου σε υγρό μεγάλης κοιλίας, η χρωστική προστίθεται στον σωλήνα, ποτέ στο ζώο. Ολόκληρη η δοκιμασία πραγματοποιείται μέσα στον σωλήνα. Η μέτρηση του χρόνου που χρειάζεται για να εξαφανιστεί το μπλε χρώμα παρέχει πληροφορίες για τα μικρόβια του συγκεκριμένου δείγματος, όχι για κάποια θεραπεία που χρειάζεται το ζώο.
Η σύγχυση είναι κατανοητή, επειδή το κυανό του μεθυλενίου εμφανίζεται σε τρία διαφορετικά κτηνιατρικά πλαίσια. Το άρθρο αυτό τα διαχωρίζει και δείχνει πώς ερμηνεύεται ο χρόνος αναγωγής σε συνδυασμό με το pH, τα πρωτόζωα, την ποιότητα της δειγματοληψίας και τα κλινικά σημεία.
Τι μετρά πραγματικά η δοκιμασία
Το κυανό του μεθυλενίου είναι μπλε όταν είναι οξειδωμένο και σχεδόν άχρωμο όταν είναι ανηγμένο. Το φρέσκο υγρό μεγάλης κοιλίας από ένα υγιές ζώο έχει ισχυρή αναγωγική ικανότητα, επειδή τα αναερόβια βακτήρια ζυμώνουν ενεργά την τροφή. Όταν αναμειγνύετε μικρή ποσότητα χρωστικής με αυτό το υγρό, ο βακτηριακός μεταβολισμός απομακρύνει το χρώμα μέσα σε λίγα λεπτά.
Η αρχή λειτουργίας είναι επομένως απλή: η ενεργή αναερόβια μικροχλωρίδα αποχρωματίζει γρήγορα το μπλε, ενώ η αδρανής ή διαταραγμένη μικροχλωρίδα το αποχρωματίζει αργά. Ο σύντομος χρόνος σημαίνει μεγαλύτερη αναγωγική ικανότητα στο συγκεκριμένο δείγμα. Ο παρατεταμένος χρόνος υποδηλώνει μειωμένη μικροβιακή δραστηριότητα, εφόσον η συλλογή και ο χειρισμός του δείγματος έγιναν σωστά.
Η δοκιμασία δεν μετρά άμεσα το οξειδοαναγωγικό δυναμικό της μεγάλης κοιλίας. Μια μελέτη μεθόδων σε βοοειδή, η οποία συνέκρινε τη δοκιμασία αναγωγής με άμεσες μετρήσεις σε millivolt, δεν βρήκε γραμμική συσχέτιση μεταξύ του χρόνου αναγωγής και του μετρούμενου οξειδοαναγωγικού δυναμικού. Κατέληξε ότι τα δύο δεν πρέπει να αντιμετωπίζονται ως εναλλάξιμες μετρήσεις της ίδιας μεταβλητής. Η πλήρης σύγκριση συνοψίζεται στο PubMed. Αντιμετωπίστε τη δοκιμασία αναγωγής ως λειτουργική αξιολόγηση του μικροβιακού πληθυσμού, όχι ως φθηνό ηλεκτρόδιο.
Η περιγραφή της απλής δυσπεψίας στα μηρυκαστικά από το Merck/MSD εντάσσει τον παρατεταμένο χρόνο αναγωγής στο ίδιο σύνολο ευρημάτων με το μη φυσιολογικό pH της μεγάλης κοιλίας και τον μειωμένο αριθμό πρωτοζώων. Καμία μεμονωμένη τιμή δεν αρκεί για τη διάγνωση. Το σύνολο των ευρημάτων είναι αυτό που μετρά.
Μια τυπική επιτόπια διαδικασία
Τα πρωτόκολλα διαφέρουν ελαφρώς μεταξύ σχολών, επομένως καταγράφετε τους ακριβείς όγκους και τη θερμοκρασία που χρησιμοποιείτε και συγκρίνετε αποτελέσματα μόνο στο πλαίσιο του ίδιου πρωτοκόλλου. Μια ευρέως διδασκόμενη εκδοχή είναι η εξής:
- Συλλέξτε τουλάχιστον 10 έως 20 mL φρέσκου υγρού μεγάλης κοιλίας, περιορίζοντας στο ελάχιστο την επιμόλυνση με σάλιο, την έκθεση στον αέρα και την ψύξη. Εξετάστε το άμεσα.
- Παρασκευάστε διάλυμα κυανού του μεθυλενίου 0.03 τοις εκατό, δηλαδή 0.3 mg ανά mL.
- Προσθέστε χρωστική σε όγκο ίσο με το 5 τοις εκατό του όγκου του υγρού. Αυτό αντιστοιχεί σε 1.0 mL χρωστικής για 20 mL υγρού ή σε 0.5 mL χρωστικής για 10 mL υγρού. Και οι δύο περιπτώσεις δίνουν την ίδια αναλογία υγρού προς χρωστική, 20 προς 1.
- Διατηρήστε έναν δεύτερο σωλήνα με υγρό από το ίδιο δείγμα, χωρίς προσθήκη χρωστικής, ως μάρτυρα για τη σύγκριση του χρώματος.
- Αναμείξτε απαλά, ξεκινήστε αμέσως το χρονόμετρο και διατηρήστε τον σωλήνα κοντά στη θερμοκρασία του σώματος, περίπου στους 37 έως 39 βαθμούς Κελσίου, ανάλογα με το τοπικό πρωτόκολλο.
- Καταγράψτε τον χρόνο μέχρι το χρώμα στον σωλήνα της δοκιμασίας να γίνει ίδιο με εκείνο του μάρτυρα. Ένας λεπτός μπλε δακτύλιος μπορεί να παραμένει στην επιφάνεια επαφής με τον αέρα, επειδή εκεί το οξυγόνο επανοξειδώνει τη χρωστική. Μην περιμένετε να εξαφανιστεί αυτός ο δακτύλιος.
Η οξειδοαναγωγική χημεία του κυανού του μεθυλενίου εξηγεί γιατί το οξυγόνο έχει σημασία εδώ. Η έντονη ανακίνηση, ένας σωλήνας με πλατύ ανοικτό στόμιο ή μια μεγάλη καθυστέρηση επιτρέπουν την είσοδο οξυγόνου και διατηρούν τη χρωστική μπλε για περισσότερο χρόνο από όσο θα συνέβαινε μέσα στη μεγάλη κοιλία. Οι λεπτομέρειες της σωστής τεχνικής συλλογής υγρού μεγάλης κοιλίας έχουν σημασία για τον ίδιο λόγο. Το σάλιο αραιώνει το δείγμα και αυξάνει το pH, γι’ αυτό, όταν χρησιμοποιείται στομαχικός καθετήρας, πολλοί κτηνίατροι απορρίπτουν την πρώτη ποσότητα, εφόσον ο διαθέσιμος όγκος το επιτρέπει.
Τι μετρούν οι διαφορετικές παρατηρήσεις
Ο χρόνος αναγωγής απαντά σε μία μόνο ερώτηση. Η παρακάτω αξιολόγηση της μεγάλης κοιλίας δείχνει τι προσφέρει κάθε επιτόπια παρατήρηση. Χρησιμοποιήστε ολόκληρη τη γραμμή, όχι ένα μόνο κελί.
| Παρατήρηση | Τι μετρά | Τυπικό επιτόπιο εύρημα | Συνήθεις συγχυτικοί παράγοντες |
|---|---|---|---|
| Χρόνος αναγωγής κυανού του μεθυλενίου | Λειτουργική αναγωγική δραστηριότητα των αναερόβιων βακτηρίων στο δείγμα | Στα βοοειδή συχνά 2 έως 6 λεπτά· στα πρόβατα και στις αίγες συχνά συντομότερος, με τα 6 λεπτά να χρησιμοποιούνται ως πρακτικό όριο επαρκούς δραστηριότητας και τους χρόνους πέραν των 10 λεπτών να θεωρούνται σαφώς μη φυσιολογικοί | Ψυχρό δείγμα, καθυστερημένη εξέταση, έκθεση στον αέρα ή αραίωση με σάλιο· λίγο υπόστρωμα μετά από παρατεταμένη ανορεξία· αντιμικροβιακά από το στόμα· σύγκριση διαφορετικών αναλογιών χρωστικής ή θερμοκρασιών |
| pH μεγάλης κοιλίας | Χημικό περιβάλλον, όξινο ή αλκαλικό φορτίο | Σε βοοειδή που τρέφονται με χονδροειδείς ζωοτροφές συχνά περίπου 6.0 έως 7.2· συγγράμματα για μικρά μηρυκαστικά αναφέρουν συχνά περίπου 6.5 έως 7.5· η διατροφή και ο χρόνος από τη σίτιση μεταβάλλουν την τιμή | Η επιμόλυνση με σάλιο αυξάνει το pH σε δείγματα μέσω στομαχικού καθετήρα· απώλεια διοξειδίου του άνθρακα μετά τη συλλογή· η σίτιση με δημητριακά μειώνει το pH |
| Αριθμός και κινητικότητα πρωτοζώων | Ακεραιότητα του πληθυσμού των βλεφαριδοφόρων, ιδίως των μεγάλων μορφών που είναι ευαίσθητες στις διαταραχές | Πολλοί οργανισμοί διαφόρων μεγεθών με έντονη κατευθυνόμενη κίνηση σε μια ζεστή, φρέσκια σταγόνα | Η ψύξη επιβραδύνει την κίνηση· η σοβαρή οξέωση μπορεί να εξαλείψει τα πρωτόζωα· η καθυστέρηση κάνει ένα φυσιολογικό δείγμα να φαίνεται υποτονικό |
| Οσμή, χρώμα και σύσταση | Χαρακτήρας της ζύμωσης και επιμόλυνση | Ελαφρώς αρωματικό, πρασινοκάστανο, ελαφρώς ιξώδες υγρό | Σηπτική ή ξινή οσμή σε σοβαρή δυσβίωση· υδαρές υγρό ή υγρό με πολύ σάλιο μετά από κακή συλλογή |
| Συσπάσεις μεγάλης κοιλίας και όρεξη | Λειτουργία των προστομάχων και πρόσληψη τροφής στο ζώο συνολικά | Τακτικές συσπάσεις και σταθερός μηρυκασμός σε ζωηρό ζώο | Πρόσφατη αλλαγή σιτηρεσίου, πόνος, αφυδάτωση, συστηματική νόσος |
Αυτό είναι το ουσιώδες μήνυμα του πίνακα. Ένας παρατεταμένος χρόνος αναγωγής μαζί με υποτονικά πρωτόζωα, μη φυσιολογικό pH και ασθενείς συσπάσεις υποδηλώνει πραγματική καταστολή της μικροβιακής δραστηριότητας. Ένας μεμονωμένος παρατεταμένος χρόνος σε ζωηρό ζώο που μηρυκάζει και έχει πρωτόζωα με έντονη κινητικότητα στρέφει την προσοχή στο δείγμα, όχι στη μεγάλη κοιλία. Επαναλάβετε τη συλλογή πριν ενεργήσετε.
Ερμηνεία του χρόνου μαζί με το pH και το ιστορικό
Η διατροφή καθορίζει το σημείο αναφοράς. Τα σιτηρέσια πλούσια σε συμπυκνωμένες ζωοτροφές ζυμώνονται γρήγορα και μπορούν να αποχρωματίσουν τη χρωστική σε περίπου ένα λεπτό, ενώ τα σιτηρέσια με σανό μπορεί να χρειαστούν αρκετά λεπτά, ακόμη και σε υγιή ζώα. Επομένως, ένας σύντομος χρόνος δεν αποδεικνύει από μόνος του καλύτερη υγεία. Δείχνει ότι περισσότερο ζυμώσιμο υπόστρωμα συνάντησε ενεργά μικρόβια.
Η σοβαρή υπερφόρτωση με δημητριακά ανατρέπει αυτή την απλή τάση. Η αρχική ζύμωση των υδατανθράκων μπορεί να είναι έντονη, αλλά στη συνέχεια η βλάβη από τα οξέα καταστέλλει τη φυσιολογική μικροχλωρίδα και τα πρωτόζωα, με αποτέλεσμα να παρατείνεται ο χρόνος αναγωγής. Γι’ αυτό ένας διδακτικός κανόνας αναφέρει ότι η δοκιμασία δεν είναι έγκυρη όταν το pH της μεγάλης κοιλίας είναι κάτω από περίπου 5.5. Σε αυτό το σημείο, η μικροχλωρίδα που εξετάζεται έχει αλλάξει.
Ένας πρακτικός οδηγός συνδυασμών ευρημάτων:
- Φυσιολογικό pH με αναγωγή μέσα σε περίπου 6 λεπτά υποδηλώνει λειτουργικά ενεργή μικροχλωρίδα.
- Φυσιολογικό pH με σαφώς παρατεταμένη αναγωγή υποδηλώνει αδράνεια λόγω ανορεξίας, επίδρασης αντιμικροβιακών ή ακατάλληλου δείγματος.
- Υψηλό pH με παρατεταμένη αναγωγή συχνά ακολουθεί παρατεταμένη ανορεξία με λίγο διαθέσιμο υπόστρωμα, αλλά εξετάστε και το ενδεχόμενο επιμόλυνσης με σάλιο από τον καθετήρα.
- Χαμηλό pH με μειωμένη δραστηριότητα πρωτοζώων εγείρει υποψία δυσβίωσης που σχετίζεται με τους υδατάνθρακες. Οι οδηγίες ερμηνείας του pH της μεγάλης κοιλίας βοηθούν εδώ. Τιμές κάτω από 5.5 με γενική καταβολή στρέφουν την εκτίμηση μακριά από την απλή δυσπεψία, προς την υπερφόρτωση με δημητριακά και τη σοβαρή οξέωση.
Καταγράφετε πάντα την πρόσφατη χορήγηση τετρακυκλινών από το στόμα, τα ιονοφόρα στις ζωοτροφές, την παρατεταμένη συστηματική χορήγηση αντιμικροβιακών, τις απότομες αλλαγές σιτηρεσίου, τη διάρκεια της ανορεξίας και την πρόσληψη νερού. Το εγχειρίδιο MSD προειδοποιεί ειδικά ότι οι τετρακυκλίνες που χορηγούνται από το στόμα μπορούν να καταστείλουν σημαντικά τη μικροχλωρίδα της μεγάλης κοιλίας. Τα ιονοφόρα μεταβάλλουν σκόπιμα τους βακτηριακούς πληθυσμούς. Χωρίς αυτό το ιστορικό, ένας παρατεταμένος χρόνος δεν μπορεί να ερμηνευτεί.
Η ποιότητα της δειγματοληψίας αξίζει την ίδια βαρύτητα. Ελεγχόμενη μελέτη διαπίστωσε ότι τα δείγματα μέσω στομαχικού καθετήρα είχαν υψηλότερο pH και χαμηλότερα επίπεδα πτητικών λιπαρών οξέων από τα δείγματα μέσω κάνουλας από τα ίδια ζώα, κυρίως λόγω του σάλιου. Ο χρόνος αναγωγής είχε παραταθεί σημαντικά στα 60 λεπτά μετά τη συλλογή για κάθε όγκο που εξετάστηκε, με τα μικρά δείγματα να επηρεάζονται περισσότερο. Συλλέξτε τουλάχιστον 10 mL, εξετάστε το δείγμα μέσα σε 30 λεπτά, εκτελέστε τη δοκιμασία αναγωγής νωρίς, διατηρήστε το δείγμα ζεστό και ελαχιστοποιήστε την επαφή με τον αέρα.
Τρεις χρήσεις που δεν πρέπει να συγχέονται
Η ίδια χρωστική, τρία διαφορετικά συστήματα.
Πρώτον, η δοκιμασία σε υγρό μεγάλης κοιλίας που περιγράφεται εδώ. Το δείγμα είναι συλλεγμένο υγρό μεγάλης κοιλίας. Η χρωστική προστίθεται in vitro σε συγκέντρωση 0.03 τοις εκατό. Το τελικό σημείο είναι ο χρόνος μέχρι τον αποχρωματισμό. Σκοπός είναι η αξιολόγηση της μικροβιακής αναγωγικής δραστηριότητας.
Δεύτερον, η χορήγηση κυανού του μεθυλενίου σε ζωντανό μηρυκαστικό. Το καθιερωμένο παράδειγμα είναι η ενδοφλέβια θεραπεία για τοξίκωση από νιτρικά ή νιτρώδη με μεθαιμοσφαιριναιμία, όπου το φάρμακο αποκαθιστά τη λειτουργική αιμοσφαιρίνη. Ισχύουν κανόνες για τη δόση, το σκεύασμα, τα κατάλοιπα και τους χρόνους αναμονής. Αυτή η απόφαση δεν έχει καμία σχέση με τη χρονομέτρηση ενός δοκιμαστικού σωλήνα. Αν η χρωστική χρησιμοποιείται ως ιχνηθέτης in vivo σε μια συγκεκριμένη διαδικασία, η αρχή αφορά το πού μετακινείται η χρωστική, όχι το πόσο γρήγορα την ανάγουν τα μικρόβια της μεγάλης κοιλίας.
Τρίτον, η δοκιμασία αναγωγής στο γάλα. Το δείγμα είναι γάλα. Η χρωστική προστίθεται στο δείγμα γάλακτος. Η γρήγορη απώλεια του μπλε χρώματος γενικά υποδηλώνει μεγαλύτερη μικροβιακή δραστηριότητα και μικρότερη δυνατότητα διατήρησης, ενώ η αργή αναγωγή υποδηλώνει καλύτερη ποιότητα. Ανήκει στη μικροβιολογία τροφίμων και στον έλεγχο ποιότητας γάλακτος, όχι στην κτηνιατρική αξιολόγηση της μεγάλης κοιλίας, και δεν αποτελεί καταμέτρηση βακτηρίων.
Η σαφής ονομασία αποτρέπει τα λάθη: χρόνος αναγωγής σε υγρό μεγάλης κοιλίας, συστηματική θεραπεία με κυανό του μεθυλενίου ή χρήση του ως ιχνηθέτη, και δοκιμασία αναγωγής στο γάλα. Ο κανόνας ασφάλειας χωρά σε μία πρόταση. Η χρωστική για τη δοκιμασία της μεγάλης κοιλίας παραμένει στον εργαστηριακό σωλήνα και ο σωλήνας αυτός απορρίπτεται. Δεν χορηγείται ποτέ στο ζώο για την εκτέλεση της δοκιμασίας.
Ένας σύντομος κανόνας για την κλήση από την κτηνοτροφική μονάδα
Τυποποιήστε τη χρωστική σε συγκέντρωση 0.03 τοις εκατό και αναλογία 1 μέρος χρωστικής προς 20 μέρη υγρού, εξετάστε φρέσκο υγρό κοντά στη θερμοκρασία του σώματος συγκρίνοντάς το με μάρτυρα χωρίς χρωστική και ερμηνεύστε τα λεπτά μαζί με το pH, την κινητικότητα των πρωτοζώων, την ποιότητα συλλογής, τη διατροφή, τα φάρμακα, τις συσπάσεις, την όρεξη, τα κόπρανα και την ενυδάτωση. Ένας μεμονωμένος αριθμός δεν αρκεί ποτέ για τη διάγνωση της δυσπεψίας. Ένα συνεκτικό σύνολο ευρημάτων αρκεί.