Wangenzellen mit Methylenblau färben: Was sich beobachten lässt

Eine Schülerin gibt einen Tropfen Wangenzellsuspension auf einen Objektträger, schaut durch das Mikroskop und sieht fast nichts. Ein paar blasse Schemen treiben durch ein helles Gesichtsfeld. Sie stellt nach, erhöht dann die Beleuchtung und kommt schließlich zu dem Schluss, dass der Objektträger leer ist. Der Objektträger ist nicht leer. Die Zellen sind vorhanden. Sie sind nahezu durchsichtig, und genau dieses Problem soll die Färbung lösen.

Diese Diskrepanz zwischen Erwartung und Bild sollte vor Beginn der Anleitung angesprochen werden. Anfänger erwarten, dass ein Mikroskop Details sichtbar macht, so wie der Zoom einer Kamera ein entferntes Schild erkennbar macht. Ein Hellfeldmikroskop leistet etwas Spezifischeres: Es zeigt Unterschiede in der Lichtabsorption. Eine ungefärbte Wangenzelle absorbiert fast kein Licht und erzeugt daher nahezu keinen Unterschied. Methylenblau schafft diesen Unterschied. Es bindet sich innerhalb der Zelle ungleichmäßig und macht aus Struktur Kontrast. Sobald die Lernenden dieses Konzept verstanden haben, erschließt sich jeder weitere Schritt als logische Folge statt als bloßes Rezept.

Hintergrundwissen dazu, wie einfache Färbungen im Schullabor Kontrast erzeugen, ist hier hilfreich. Eine Auffrischung zur Einrichtung eines Hellfeldmikroskops vor dem Färben verhindert die Hälfte der misslungenen Präparate. Die Chemie hinter der Farbe wird in einer Einführung zu Methylenblau in der Mikroskopie erläutert. Dort wird erklärt, warum gerade dieser Farbstoff immer wieder auf dem Labortisch zu finden ist.

Die Anleitung für den Unterricht

Das unten beschriebene Nasspräparat ist die einfachere Standardvariante für den allgemeinen Unterricht. Es benötigt weder eine Flamme noch einen Fixierungsschritt. Bei der Variante mit fixiertem Ausstrich, die in einigen Hochschulhandbüchern verwendet wird, kommen Lufttrocknung und eine kurze Hitzefixierung hinzu, etwa in der über Biology LibreTexts veröffentlichten Übung zum Wangenzellausstrich des North Central Texas College. Die Hitzefixierung ist jedoch eine übliche Vorgehensweise in der Mikrobiologie und keine Voraussetzung dafür, Epithelzellen zu sehen.

Benötigt werden: saubere Objektträger und Deckgläser, sterile Einmaltupfer (bevorzugt) oder neue flache Zahnstocher, eine Tropfflasche mit 0.5 bis 1 Prozent wässriger Methylenblaulösung, destilliertes oder deionisiertes Wasser, Löschpapier, Handschuhe und ein zusammengesetztes Lichtmikroskop mit 100x und 400x Gesamtvergrößerung.

1. Den Mund mit klarem Wasser ausspülen. Dadurch werden Speisereste entfernt, die sich später intensiv anfärben und von den Zellen ablenken.
2. Alle Lernenden entnehmen ausschließlich Proben von ihrer eigenen Wangeninnenseite. Mit einem frischen sterilen Tupfer sanft über die Innenseite der Wange reiben. Andrücken, nicht kratzen. Aufhören, lange bevor Beschwerden oder Blutungen auftreten.
3. Den Tupfer über die Mitte eines sauberen Objektträgers rollen, sodass ein dünner Film entsteht. Ein dünner Film ist der wichtigste Faktor für ein gut auswertbares Präparat. Ein dicker weißer Belag wird durch die Färbung zu einer nicht auswertbaren blauen Masse.
4. Einen Tropfen Methylenblau auf den Ausstrich geben. 1 bis 3 Minuten einwirken lassen. In vielen Hochschulanleitungen genügt eine Minute; das naturwissenschaftliche Laborhandbuch der NCERT für Klasse IX sieht für ein temporäres Präparat etwa 3 Minuten vor. Länger ist nicht besser, und Überfärbung ist der häufigste Fehler bei der Einwirkzeit.
5. Gemäß der örtlichen Anleitung vorsichtig mit destilliertem Wasser spülen oder überschüssigen Farbstoff mit Löschpapier absaugen. Der Hintergrund sollte blassblau werden, nicht dunkelblau.
6. Ein Deckglas schräg absenken, sodass zuerst eine Kante aufliegt, und es dann langsam herunterlassen. Dadurch werden Luftblasen vermieden.
7. Mit geringer Vergrößerung beginnen, um die Zellen zu finden, Schärfe und Zentrierung prüfen und dann zu 100x und schließlich zu 400x wechseln. Bei 400x ausschließlich den Feintrieb verwenden.

Zur Farbstoffkonzentration ist eine präzise Angabe nötig. Schulanleitungen verwenden meist wässrige Methylenblaulösungen mit etwa 1 Prozent. Eine höher konzentrierte Stammlösung oder eine lange Einwirkzeit verstärkt die Färbung des Hintergrunds schneller als die des Zellkerns. Dadurch kehrt sich der Kontrast um, auf dem die Übung beruht.

Sicherer Umgang mit Wangenmaterial

Wangenproben enthalten Speichel und normale Mikroorganismen der Mundhöhle. Deshalb ist jeder frische Ausstrich als potenziell infektiöses Material zu behandeln, auch wenn die Proben von gesunden Mitschülerinnen und Mitschülern stammen. Die Richtlinien der American Society for Microbiology zur biologischen Sicherheit in Lehrlaboren nennen die allgemeinen Grundsätze: Risiken vor der Unterrichtseinheit bewerten, Handschuhe tragen, bei möglicher Spritzgefahr die Augen schützen, anschließend die Hände waschen, Arbeitsflächen desinfizieren und kontaminierte Einwegmaterialien über den vorgesehenen Entsorgungsweg für biologische Abfälle entsorgen.

Vier Unterrichtsregeln decken den Großteil des Risikos ab. Jeder Tupfer und jeder Objektträger wird nur für eine Person verwendet und niemals geteilt. Proben werden ausschließlich bei sich selbst entnommen, niemals bei der Person nebenan. Einmaltupfer und Zahnstocher kommen direkt in den vorgesehenen Abfallbehälter und niemals zurück auf die Arbeitsfläche. Methylenblau selbst färbt Haut und Kleidung und reizt die Augen. Daher gelten Handschuhpflicht und die üblichen Hygieneregeln für den Umgang mit Farbstoffen. Die Übung darf nicht um die Kultivierung von Material aus dem Ausstrich erweitert werden. Eine Hitzefixierung von frischem menschlichem Material darf nicht außerhalb des schulischen Sicherheitsverfahrens improvisiert werden.

Was sich beobachten lässt und warum es so aussieht

Bei 100x sind breite, flache, blassblaue Zellen mit unregelmäßig ovalen oder polygonalen Umrissen zu suchen. Sie liegen einzeln oder in lockeren, überlappenden Zellverbänden vor. Jede Zelle weist normalerweise einen dunkleren blauen Fleck auf. Dieser Fleck ist der Zellkern. Auch die Anordnung sollte beachtet werden: Plattenepithelzellen sind dünne Plättchen, keine Kugeln. Deshalb ähneln ihre Ränder eher einer rissigen Glasur als runden Ballons.

Bei 400x lassen sich drei Merkmale deutlich unterscheiden. Die Zellgrenze erscheint als dünne, dunklere Linie, die die Zelle umschließt. Das Zytoplasma füllt das Zellinnere mit einem hellen, gleichmäßigen Blau. Der Zellkern ist dunkler und kompakter, oft oval und meist nahe der Mitte, aber nicht immer. Die Lernenden sollen alle drei Merkmale sowie Form und Vergrößerung festhalten, denn genau danach fragt das Arbeitsblatt.

Ein Punkt ist für die sachliche Genauigkeit wichtig und wird auf vielen Arbeitsblättern falsch dargestellt. Die sichtbare Grenze entspricht dem Bereich der Plasmamembran. Die Membran selbst, eine etwa 7 bis 10 Nanometer dicke Lipiddoppelschicht, liegt jedoch weit unterhalb der Auflösungsgrenze eines Schulmikroskops. Zu sehen sind der optische Rand der Zelle und dort angereicherter Farbstoff. Dieselbe Einschränkung gilt für Organellen. Mitochondrien, endoplasmatisches Retikulum, Golgi-Apparat und Ribosomen sind in diesem Präparat nicht sichtbar. Ein herkömmliches Lichtmikroskop erreicht unter guten Bedingungen eine Auflösung von etwa 0.2 Mikrometern, wie die zellbiologischen Hintergrundinformationen des NCBI zu Mikroskopietechniken erläutern. Die meisten ultrastrukturellen Details liegen unterhalb oder nahe dieser Grenze. Eine weitere leere Vergrößerung macht das Bild größer, ohne zusätzliche Details sichtbar zu machen.

Warum färbt sich der Zellkern am dunkelsten? Methylenblau ist ein kationischer Farbstoff, der in Lösung positiv geladen ist und sich an negativ geladenes Material in der Zelle anlagert, vor allem an Nukleinsäuren. Im Chromatin ist DNA im Zellkern konzentriert, sodass sich dort der meiste Farbstoff ansammelt. Das Zytoplasma enthält RNA und andere geladene Moleküle und wird deshalb ebenfalls gefärbt, allerdings diffuser und heller. Die entscheidende Einschränkung: Methylenblau ist kein DNA-spezifischer Farbstoff. Arbeiten zur Verteilung von Methylenblau bei der Bildgebung von Zellkernen beschreiben die Anlagerung des Kations an nukleinsäurereiche Bereiche. Ältere quantitative Untersuchungen zur Bindung von Methylenblau in Zellpräparaten ergaben, dass der größte Teil des gebundenen Farbstoffs mit Nukleinsäuren assoziiert war. Ein dunkler Zellkern bei hellem Zytoplasma ist daher ein Kontrastmuster und kein molekularer Nachweis.

Typische Fehler der Lernenden und ihre Einordnung

Fast jedes misslungene Präparat lässt sich einem von fünf Mustern zuordnen. Die Lernenden sollten lernen, das Präparat zu beurteilen, statt es ohne Ursachenprüfung erneut anzufertigen.

Bei Überfärbung werden Zellen und Hintergrund gleichmäßig dunkel, sodass der Zellkern im Gesichtsfeld nicht mehr zu erkennen ist. Abhilfe schaffen eine kürzere Färbezeit oder gründlicheres Spülen. Bei zu schwacher Färbung bleiben blasse Schemen zurück, die bei stärkerer Beleuchtung verschwinden; die Einwirkzeit in Schritten von dreißig Sekunden verlängern. Dicke Ausstriche ergeben dichte, überlappende Massen, in denen sich kein Umriss nachverfolgen lässt. Die Korrektur erfolgt mechanisch: Beim nächsten Mal dünner ausstreichen, denn keine Spülung kann einen Zellhaufen retten. Luftblasen erscheinen als perfekte Kreise mit scharfen dunklen Rändern und lenken Anfänger ab, die sie für Strukturen halten; das Deckglas erneut langsam und schräg auflegen. Winzige dunkle Punkte auf oder um die Zellen sind meist normale Mundbakterien, wie Schulanleitungen etwa im Verfahren zur Untersuchung von Wangenzellen von Ingrid Science erläutern. Sie zeigen, dass der Mund besiedelt ist, was den Lernenden im Gedächtnis bleiben kann. In dieser Übung lassen sie sich jedoch nicht bis zur Art bestimmen und sollten nicht als Zellbestandteile eingezeichnet werden. Speisereste und Schleimfäden färben sich unregelmäßig und intensiv; das vorherige Ausspülen soll ihre Menge verringern.

Was diese Übung nicht leisten kann

Dies ist eine Beobachtungsübung für den Unterricht, kein diagnostischer Test. Aus dem Aussehen von Zellen in einem im Unterricht gefärbten Präparat lassen sich weder Infektionen noch Krebs oder andere Krankheiten diagnostizieren. Der Artikel darf nicht so verstanden werden, als lege er etwas anderes nahe. Das Präparat zeigt Form, Grenze, Zytoplasma und Zellkern bei zwei Vergrößerungen. Es zeigt weder die Ultrastruktur der Membran noch Details der Organellen oder die molekulare Identität. Diese Grenze ausdrücklich zu benennen schützt sowohl die wissenschaftliche Genauigkeit als auch die Lernenden: Ein gutes Ergebnis ist eine korrekt beschriftete Zeichnung mit dokumentierter Vergrößerung und Färbung, keine Schlussfolgerung über die Gesundheit.

Arbeitsblatt und beschriftete Mikroaufnahmen

Die beiden Unterrichtsmaterialien zu dieser Seite sind die oben gezeigte beschriftete Mikroaufnahme und das folgende Arbeitsblatt. Das Arbeitsblatt einmal pro Person ausdrucken oder projizieren und die Lernenden die Felder in ihre Hefte übertragen lassen.

So lässt es sich in einer 45-minütigen Unterrichtseinheit einsetzen: zehn Minuten für Sicherheitsunterweisung und Probenentnahme, zehn Minuten für Färbung und Präparation, fünfzehn Minuten für Beobachtung und Zeichnung bei beiden Vergrößerungen sowie zehn Minuten für die Checkliste und den Vergleich mit der beschrifteten Mikroaufnahme. Die Punkte der Checkliste sind bewusst auf konkrete Arbeitsschritte und Beobachtungen ausgerichtet. Dünner Ausstrich, korrekte Färbezeit, Zellkern dunkler als Zytoplasma, Vergrößerung dokumentiert. Wer alle vier Punkte abhaken kann, hat das Konzept verstanden, das die Unterrichtseinheit vermitteln soll: Mikroskope zeigen Unterschiede, und Färbungen erzeugen die Unterschiede, die sichtbar gemacht werden sollen.