Methylenblau und Lichtexposition: Wellenlänge, Bestrahlungsstärke und Behandlungsgeometrie

Zwei Veröffentlichungen berichten, dass Methylenblau mit einer Lichtdosis von 10 J pro Quadratzentimeter bestrahlt wurde. In der einen werden Bakterien abgetötet. In der anderen lässt sich keine Wirkung messen. Wer nur die Dosis vergleicht, schließt daraus, dass die Ergebnisse des Forschungsgebiets widersprüchlich sind. Das Forschungsgebiet liefert jedoch konsistente Ergebnisse. Die Dosis allein hat die Exposition nie vollständig beschrieben.

Eine Lichtexposition ist ein kleines System zusammenwirkender Parameter: Wellenlänge, Bestrahlungsstärke, Dauer, die daraus resultierende Fluenz, Sauerstoffverfügbarkeit, Farbstoffkonzentration und Aggregationszustand, der zeitliche Abstand zwischen Farbstoffgabe und Bestrahlung sowie der optische Weg, den das Licht tatsächlich durch die Probe zurücklegt. Ändert sich einer dieser Parameter, ändert sich die Photochemie. Dieser Artikel erläutert jeden Parameter und unterscheidet anschließend die Photobiomodulation mit nahem Infrarotlicht von der direkten Photoaktivierung des Farbstoffs, da diese beiden Verfahren am häufigsten verwechselt werden.

Die Wellenlänge entscheidet, ob der Farbstoff beteiligt ist

Methylenblau absorbiert in Wasser als Monomer stark im roten Spektralbereich, mit einem Maximum nahe 664 bis 665 nm und einer Schulter bei einer kürzeren Wellenlänge nahe 610 nm, die ausgeprägter wird, wenn der Farbstoff zu Dimeren und größeren Stapelaggregaten aggregiert. Der molare Extinktionskoeffizient nahe dem Maximum liegt in der Größenordnung von 65,000 bis 85,000 M-1 cm-1, sodass bereits mikromolare Lösungen intensiv blau sind. Die frühe photochemische Übersichtsarbeit zu Methylenblau mit DNA und biologischen Substraten dokumentiert dieses Absorptionsverhalten und die anschließende Chemie der angeregten Zustände: Durch Absorption wird ein kurzlebiger Singulettzustand besetzt, der mit berichteten Ausbeuten nahe 0.5 in einen langlebigeren Triplettzustand übergeht. In belüfteter Lösung wird dieser innerhalb von etwa 2 Mikrosekunden durch Sauerstoff gequencht.

Bei diesem Quenching-Schritt trennen sich die beiden photochemischen Reaktionswege. In der Typ-II-Chemie überträgt der Farbstoff im Triplettzustand Energie auf Sauerstoff im Grundzustand und erzeugt Singulettsauerstoff, mit häufig angegebenen Ausbeuten nahe 0.52. In der Typ-I-Chemie überträgt der Triplettzustand stattdessen ein Elektron oder Wasserstoff auf ein Substrat. Dabei entstehen Radikale, darunter Superoxid- und Hydroxylspezies. Beide Reaktionswege können gleichzeitig ablaufen, und die konventionelle photodynamische Wirkung bleibt stark sauerstoffabhängig, auch wenn Typ I dazu beiträgt.

Für die Wahl der Wellenlänge bei Methylenblau ergibt sich daraus eine einfache Regel. Rotes Licht von etwa 630 bis 680 nm überlappt mit der Absorptionsbande des Farbstoffs. 660 bis 665 nm liegen nahe dem Absorptionsmaximum des Monomers. Dieses Licht kann daher überall dort photosensibilisierte Reaktionen auslösen, wo Farbstoff in nennenswerter Menge vorhanden ist. Nahes Infrarotlicht bei 810 nm liegt weit außerhalb der Absorptionsbande des Grundzustands und eignet sich daher schlecht zur direkten Anregung des Farbstoffs. Die Konzentration macht den Zusammenhang in einem wesentlichen Punkt komplexer: Mit steigender Konzentration liegt mehr Farbstoff in dimerer und aggregierter Form vor. Diese Formen absorbieren eher in Richtung 610 nm und photosensibilisieren pro Molekül weniger effizient. Eine Verdopplung der Farbstoffmenge verdoppelt daher nicht die Wirkung. Die ergänzende Übersichtsarbeit zu Methylenblau und Rotlichttherapie behandelt diese Absorptionsregel als Voraussetzung für jede photosensibilisierte Reaktion.

Bestrahlungsstärke, Dauer und Fluenz sind drei Parameter, nicht einer

Die Fluenz in J pro Quadratzentimeter ergibt sich aus der Bestrahlungsstärke multipliziert mit der Zeit. Wird nur die Fluenz angegeben, bleibt verborgen, mit welcher Rate die Energie zugeführt wurde. Diese Rate ist jedoch entscheidend.

Eine hohe Bestrahlungsstärke über kurze Zeit und eine niedrige Bestrahlungsstärke über lange Zeit können dieselbe Fluenz ergeben, aber unterschiedliche chemische Abläufe verursachen. Bei hoher Bestrahlungsstärke wird gelöster Sauerstoff schneller verbraucht, als er durch Diffusion nachgeliefert wird. Dadurch wird der sauerstoffabhängige Typ-II-Reaktionsweg im Verlauf der Exposition gedrosselt. Außerdem entsteht Wärme, auf die Gewebe mit Veränderungen der Durchblutung reagiert. Diese verändern sowohl die Sauerstoffversorgung als auch die Farbstoffverteilung. Bei niedriger Bestrahlungsstärke über eine lange Expositionsdauer bleibt die Sauerstoffversorgung erhalten. Zugleich haben Reparaturprozesse und die erneute Sauerstoffversorgung Zeit, bereits während der Exposition zu wirken. In Lehrbüchern der Photochemie wird die Annahme, dass nur die Gesamtdosis zählt, als Reziprozität bezeichnet. Sie gilt nicht mehr, sobald Sauerstoff, Erwärmung oder biologische Prozesse beteiligt sind. Im Gewebe ist das nahezu immer der Fall.

Bei antimikrobiellen photodynamischen Expositionen mit Methylenblau am Menschen werden häufig 6 bis 18 J pro Quadratzentimeter eingesetzt. Dieser Bereich überschneidet sich mit den Werten der Photobiomodulation. Die Fluenz allein erlaubt daher keine Zuordnung des Verfahrens. Eine Exposition mit 10 J pro Quadratzentimeter bei 660 nm in Gewebe, das Farbstoff enthält, ist eine durch einen Photosensibilisator ausgelöste photochemische Reaktion. Dieselbe Fluenz bei 810 nm in Gewebe mit Farbstoffspuren beschreibt etwas völlig anderes. Die Zahl stimmt überein. Das Konzept unterscheidet sich.

Optischer Weg und Probengeometrie bestimmen, worauf das Licht trifft

Nach dem Beer-Lambert-Gesetz erreicht die Vorderseite einer Probe wesentlich mehr Licht als die Rückseite. In einer Küvette mit einer Farbstoffkonzentration im Bereich einiger zehn Mikromolar kann der erste Millimeter den größten Teil des einfallenden roten Lichts absorbieren. Tiefere Schichten bleiben dadurch praktisch unbestrahlt. Wird dieselbe Lösung mit geringem Volumen in eine flache Vertiefung gegeben, wird die Exposition nahezu gleichmäßig. Derselbe Farbstoff, dieselbe Lampe, dieselbe Fluenz an der Oberfläche, aber ein anderes Ergebnis.

Im Gewebe kommt zur Absorption die Streuung hinzu. Rotes Licht nahe 660 nm dringt in der Größenordnung von Millimetern ein. Die genaue Tiefe hängt vom Blutgehalt, der Pigmentierung und dem Gewebetyp ab. Vertiefungen in Mikrotiterplatten verursachen eigene Artefakte: Linseneffekte durch den Meniskus, Reflexionen an den Wänden, Abschattung der Randvertiefungen und Erwärmung kleiner Volumina unter der Lichtquelle. Zwei Labore, die identische Lampeneinstellungen, aber unterschiedliche Plattentypen, Volumina oder Abstände zur Lichtquelle angeben, haben unterschiedliche Experimente durchgeführt.

Der Abstand verdient besondere Aufmerksamkeit, weil er die häufigste nicht angegebene Variable ist. Bei einer nicht kollimierten Lichtquelle nimmt die Bestrahlungsstärke mit zunehmendem Abstand rasch ab. Wird eine Lampe von 2 cm auf 5 cm über der Platte verschoben, kann die Bestrahlungsstärke um ein Mehrfaches sinken, während der Methodenteil weiterhin gleich lautet. Ohne eine Messung der Bestrahlungsstärke an der Probenoberfläche sind veröffentlichte Fluenzwerte, die aus Leistungsangaben des Herstellers berechnet wurden, Schätzungen und keine Messungen.

Kommentierter Parameterleitfaden: Was eine Exposition reproduzierbar macht

Die eigens für diese Seite erstellte Darstellung ist eine Checkliste. Fehlen diese Angaben zur Lichtexposition einer Studie, lässt sie sich nicht mit einer anderen vergleichen, unabhängig davon, wie ähnlich die angegebene Dosis erscheint.

1. Wellenlänge und Bandbreite. Maximum und volle Breite statt einer Farbbezeichnung. Rote LEDs decken 630 bis 680 nm ab, einen Bereich mit sehr unterschiedlicher Farbstoffabsorption.
2. Gemessene Bestrahlungsstärke an der Probenoberfläche in mW pro Quadratzentimeter. Die Leistungsangabe des Herstellers in Watt ist keine Bestrahlungsstärke.
3. Dauer und Pulsbetrieb. Kontinuierliche oder gepulste Bestrahlung, gegebenenfalls einschließlich Pulsfrequenz und Tastgrad.
4. Fluenz, berechnet aus der oben genannten gemessenen Bestrahlungsstärke und der Dauer, in J pro Quadratzentimeter.
5. Farbstoffkonzentration, Formulierung und Aggregationszustand. Das Monomer nahe 664 nm photosensibilisiert anders als Aggregate nahe 610 nm.
6. Intervall zwischen Wirkstoffgabe und Bestrahlung. Minuten bis Stunden zwischen Farbstoffgabe und Bestrahlung bestimmen, wo sich der Farbstoff befindet, wenn das Licht eintrifft.
7. Sauerstoffversorgung. Belüftete Lösung gegenüber hypoxischem Gewebe verändert das Verhältnis von Typ I und Typ II unmittelbar.
8. Geometrie. Probentiefe, Volumen, Gefäßtyp, Abstand und Winkel der Lichtquelle sowie die Tiefe des Zielbereichs im Gewebe.

Eine hilfreiche Gewohnheit beim Lesen von Veröffentlichungen: Prüfen Sie zuerst das Intervall zwischen Wirkstoffgabe und Bestrahlung. Es zeigt die Absicht des Versuchs. Bei photodynamischen Versuchsansätzen wird Gewebe, das Farbstoff enthält, gezielt bestrahlt. Bei Kombinationsansätzen können beide Anwendungen bewusst zeitlich getrennt werden, wie im Folgenden beschrieben.

Photobiomodulation mit nahem Infrarotlicht ist keine Photoaktivierung des Farbstoffs

Die Photobiomodulation, meist als PBM abgekürzt, verwendet rotes oder nahes Infrarotlicht, um körpereigene Signalprozesse zu modulieren, ohne einen Photosensibilisator hinzuzufügen. Die photodynamische Therapie, meist als PDT abgekürzt, nutzt drei Komponenten gemeinsam: Licht, das der Sensibilisator absorbiert, den Sensibilisator selbst und Sauerstoff. Zusammen erzeugen sie kurzzeitig reaktive Spezies, die das Ziel schädigen. Eine Übersichtsarbeit zu Mitochondrien als Ziel der Neuroprotektion kombiniert Methylenblau mit PBM, weil beide auf unterschiedlichen Wegen auf die Zellatmung einwirken: Der Farbstoff wirkt als katalytischer Redoxvermittler, der den Elektronenfluss unterstützt. Für PBM wird dagegen angenommen, dass sie die Ablösung hemmenden Stickstoffmonoxids von der Cytochrom-c-Oxidase am Komplex IV fördert. Dieser Enzymmechanismus sollte ausdrücklich als Hypothese gekennzeichnet bleiben.

Die beiden am häufigsten zitierten Kombinationsstudien an Mäusen verwenden jeweils Licht bei 810 nm. Genau deshalb belegen sie keine Photoaktivierung des Farbstoffs. In einer Studie zur Vorbehandlung vor Schlafentzug erhielten Mäuse vor dem Schlafentzug täglich Methylenblau mit 0.5 mg pro kg, jeden zweiten Tag einen gepulsten Laser bei 810 nm oder beides. Die kombinierte Vorbehandlung schützte gedächtnisbezogenes Verhalten und synaptische Proteine im Hippocampus, während die Einzelbehandlungen weitgehend erfolglos blieben. In einer Studie zu chronischem Stress mit begleitender Behandlung erhielten Mäuse PBM bei 810 nm mit 8 J pro Quadratzentimeter zusammen mit einer täglichen Farbstoffgabe von 0.5 mg pro kg. Der Laser wurde zuerst angewendet und der Farbstoff zwei Stunden später injiziert, ausdrücklich um die Bestrahlung von Gewebe mit enthaltenem Farbstoff zu vermeiden. In allen drei Behandlungsarmen wurden Lerndefizite rückgängig gemacht. Ein additiver Nutzen zeigte sich hauptsächlich beim Serumcortisol und bei reaktiven Sauerstoffspezies im Gehirn. Diese Ergebnisse prüfen zwei gemeinsam angewendete mitochondriale Interventionen. Die Sammlung photodynamischer Studien macht diese Unterscheidung sichtbar, indem sie die Wellenlänge für jede Indikation erfasst.

Die Evidenz zur Haut liegt auf der anderen Seite dieser Unterscheidung. Humandaten zur Kombination von Methylenblau und Licht an der Haut konzentrieren sich auf 630 bis 680 nm mit topisch oder intraläsional angewendetem Farbstoff und dem Ziel einer Gewebezerstörung oder eines Gewebeumbaus. Das ist definitionsgemäß PDT. Wer die dabei beobachtete Beseitigung von Hautveränderungen als Beleg dafür anführt, dass der Farbstoff PBM verstärkt, oder die Wiederherstellung von Funktionen bei Mäusen unter 810 nm als Beleg dafür, dass ein 660-nm-Panel zusammen mit Farbstoff ein Protokoll zur Förderung der Kognition darstellt, vermischt diese Verfahren. Das Referenzwerk zu Dosierung und Pharmakologie sowie der Leitfaden zu Sicherheit und Wechselwirkungen vertiefen die Aspekte zu Konzentration und Kontraindikationen.

Benennen Sie das Konzept, bevor Sie Zahlen vergleichen. Die Wellenlänge bestimmt, ob der Farbstoff absorbiert. Bestrahlungsstärke und Dauer bestimmen, welche chemischen Abläufe diese Absorption auslöst. Die Geometrie bestimmt, welcher Teil der Probe davon überhaupt betroffen ist. Zwei Expositionen, die in einem Parameter übereinstimmen und sich in den übrigen unterscheiden, sind unterschiedliche Experimente. Sie als austauschbar zu behandeln, ist der Fehler, den dieser Leitfaden verhindern soll. Daraus lässt sich kein Protokoll für die Anwendung zu Hause ableiten. Licht mit einer zur Farbstoffabsorption passenden Wellenlänge verwandelt zusammen mit systemisch verabreichtem Farbstoff eine ansonsten modulierende Exposition in eine durch einen Photosensibilisator ausgelöste photochemische Reaktion, die in klinische Hände gehört.