Warum Methylenblau als Gegenfärbung bei der Färbung säurefester Bakterien verwendet wird

Eine Laborfachkraft untersucht einen Sputumausstrich nach Abschluss der gesamten Färbeabfolge. Rote Stäbchen heben sich von einem blauen Gesichtsfeld ab, und der Befund lautet: säurefeste Stäbchen nachgewiesen. Am nächsten Tag zeigt ein anderer Objektträger ein gleichmäßig blaues Gesichtsfeld ohne rote Stäbchen, und der Befund wird als negativ auf Tuberkulose angegeben. Einer dieser Befunde behauptet mehr, als der Objektträger belegt, und es ist nicht der erste.

Die Verwechslung liegt im Verständnis des Verfahrens. Die Laborfachkraft betrachtete den blauen Farbstoff als Teil der Nachweischemie, als würde Methylenblau dabei helfen, die Mykobakterien zu finden. Das tat es nicht. Sobald Methylenblau den Objektträger berührt, ist die eigentliche Prüfung bereits abgeschlossen. Der Farbstoff färbt lediglich den Hintergrund, damit das Ergebnis ablesbar ist. Dieser Artikel erklärt die Funktion von Methylenblau bei der Färbung säurefester Bakterien, warum dafür Blau statt einer anderen Farbe verwendet wird und welche Schlussfolgerungen rote Strukturen vor blauem Hintergrund erlauben.

Die kurze Antwort

Die Färbung säurefester Bakterien ist ein Differenzierungsverfahren, das auf drei Prinzipien beruht. Karbolfuchsin, der Primärfarbstoff, wird in jede Zelle eingebracht, einschließlich der Mykobakterien mit ihrer wachsartigen Hülle. Säurealkohol, das Entfärbungsmittel, entfernt den roten Farbstoff aus gewöhnlichen Zellen, kann ihn jedoch nicht aus säurefesten Zellen herauslösen. Methylenblau, der Gegenfarbstoff, färbt anschließend alles, dem das Entfärbungsmittel den Farbstoff entzogen hat. Dadurch erscheinen nicht säurefeste Zellen, Wirtszellen und Zelltrümmer blau, während säurefeste Stäbchen rot bleiben. Die Gegenfärbung liefert den Kontrast. Sie hat keinen Anteil an der Chemie, die eine Zelle säurefest macht.

Was die einzelnen Schritte bewirken

Das folgende Diagramm zeigt die Aufgabenverteilung. Lesen Sie es von links nach rechts als Verfahrensablauf. Der untere Streifen erinnert daran, dass jede Gruppe von Färbeverfahren eine andere Frage beantwortet.

Zuerst erfolgt das Eindringen des Farbstoffs. Mykobakterien widerstehen gewöhnlichen wässrigen Farbstoffen, weil ihre Hülle ungewöhnlich hydrophob ist. Deshalb erzwingt das Protokoll das Eindringen. Bei der Ziehl-Neelsen-Methode treibt Erhitzen bis zur Dampfbildung phenolhaltiges Karbolfuchsin durch die wachsartige Zellwand. Bei der Kinyoun-Kaltmethode wird die Hitze durch eine wesentlich stärker konzentrierte Primärfarbstofflösung ersetzt; einige modifizierte Varianten ohne Erhitzen enthalten zusätzlich Tenside. Die Protokolle der American Society for Microbiology zur Färbung säurefester Bakterien dokumentieren beide Rezepturen nebeneinander. Der Konzentrationsunterschied ist beträchtlich: ungefähr 0.3 g basisches Fuchsin pro 100 mL bei der Methode mit Erhitzen gegenüber etwa 4 g bei der Kaltmethode.

Danach erfolgt die Differenzierung. Säurealkohol, üblicherweise 3 mL konzentrierte Salzsäure in 97 mL 95-prozentigem Ethanol, wäscht den roten Farbstoff aus jeder Zelle heraus, deren Wand keinen besonderen Widerstand bietet. Zellen mit intakter mykobakterieller Lipidhülle halten den Farbstoff zurück. Dies ist der entscheidende Schritt des gesamten Verfahrens und zugleich der Schritt, der am empfindlichsten auf die Durchführung reagiert, wie weiter unten erläutert wird.

Zuletzt wird der Kontrast hergestellt. Auf dem Objektträger befinden sich nun rote säurefeste Zellen vor einem nahezu farblosen Hintergrund aus entfärbten Zellen. Methylenblau mit 0.3 Prozent w/v macht diesen Hintergrund wieder sichtbar, und zwar in einer Farbe, die sich möglichst deutlich von Rot unterscheidet. Die Gegenfärbung dauert nur kurz, typischerweise 20 bis 30 Sekunden bei der Methode mit Erhitzen und bis zu einigen Minuten bei manchen Varianten der Kaltmethode. Die Dauer richtet sich nach dem Protokoll und ist keine Eigenschaft des Farbstoffs selbst.

Warum dieser Farbstoff und warum Blau

Methylenblau ist ein kationischer basischer Farbstoff. Das bedeutet, dass sein farbiges Ion positiv geladen ist und an die negativ geladenen Oberflächen entfärbter Bakterien, Wirtszellen und Zelltrümmer bindet. OpenStax Microbiology beschreibt dieses Ladungsprinzip als allgemeine Grundlage basischer Färbungen. Methylenblau ist hier jedoch chemisch nicht einzigartig. Auch Kristallviolett und Safranin sind basische Farbstoffe. Die Wahl beruht auf optischen, nicht auf chemischen Eigenschaften.

Rote Stäbchen benötigen einen Hintergrund in einem kontrastierenden Farbton, und Blau bietet in der Hellfeldmikroskopie einen besonders geeigneten Kontrast zu Rot. Safranin wäre ein schlechter Gegenfarbstoff, weil sein rosa-roter Endfarbton dem zurückgehaltenen Karbolfuchsin zu ähnlich ist und damit genau die Unterscheidung aufhebt, die das Verfahren geschaffen hat. Kristallviolett würde einen dunkelvioletten Hintergrund erzeugen, der mit den dünnen roten Stäbchen um die Aufmerksamkeit konkurriert. Der stärkste Beleg dafür, dass die Aufgabe im Kontrast und nicht in der Chemie liegt, ist die Austauschbarkeit: Grüne Gegenfarbstoffe wie Malachitgrün und Brillantgrün werden in einigen veterinärmedizinischen und modifizierten Protokollen verwendet, und das Verfahren funktioniert weiterhin, weil jeder deutlich abweichende Farbton dieselbe Aufgabe erfüllt.

Daraus ergeben sich zwei praktische Konsequenzen. Erstens sieht die Standardrezeptur keine pH-Anpassung vor. Verwechseln Sie diese einfache wässrige Lösung mit 0.3 Prozent nicht mit alkalischen Formulierungen wie Löfflers Methylenblau, die zu einem anderen Färbekonzept gehören. Zweitens schadet eine zu intensive Gegenfärbung. Die histologische Fachliteratur warnt ausdrücklich davor, dass ein zu dicht gefärbter blauer Hintergrund vereinzelt vorhandene Stäbchen verdecken kann. Den Objektträger länger mit Farbstoff zu bedecken, als das Protokoll erlaubt, verschlechtert daher die Ablesbarkeit, ohne einen Nutzen zu bringen.

Die Zellwandchemie, die das Verfahren ermöglicht

Dass Säurealkohol zwischen den Zellen unterscheidet, liegt an der mykobakteriellen Hülle. Ihr struktureller Kern ist der Mykolyl-Arabinogalaktan-Peptidoglykan-Komplex: Peptidoglykan ist mit Arabinogalaktan verbunden, dessen äußere Enden sehr langkettige Mykolsäuren tragen. Diese bilden eine lipidreiche äußere Mykomembran mit ungewöhnlich geringer Durchlässigkeit. Die Übersichtsarbeit zur äußeren Membran der Mykobakterien beschreibt diesen Aufbau im Detail. Die Barriere wirkt in beide Richtungen. Sie erschwert das Eindringen des Farbstoffs, weshalb dafür Hitze oder eine stärker konzentrierte Primärfarbstofflösung erforderlich ist. Sie erschwert auch das Herauslösen des Farbstoffs, weshalb Säurealkohol das Karbolfuchsin nicht mehr entfernen kann, sobald es eingedrungen ist. Gewöhnliche Bakterien besitzen diese Hülle nicht und verlieren den Farbstoff. Säurefestigkeit ist daher am besten als Phänomen einer Lipidbarriere zu verstehen, nicht als chemische Bindung von Fuchsin an Mykolsäure.

Diese Chemie erklärt auch ein häufiges Rätsel: Mykobakterien lassen sich mit der Gram-Methode schlecht und unvorhersehbar färben. Manchmal erscheinen sie als schwach gefärbte, perlschnurartige Formen oder als ungefärbte Zellschemen. Ihre hydrophobe Zellwand begrenzt das Eindringen von Kristallviolett. Die Färbung säurefester Bakterien ist keine modifizierte Gram-Färbung. Sie beruht auf einem anderen Differenzierungsprinzip, das eine andere Eigenschaft der Zellwand nutzt, wie der Vergleich zwischen Einfachfärbung und Gram-Färbung für die beiden anderen Verfahren zeigt.

Drei Methoden, drei Fragen

Weitere Informationen zur Gruppe der bakteriellen Färbeverfahren mit nur einem Farbstoff finden Sie im Atlas mikroskopischer Färbungen.

Was Rot vor Blau nicht belegen kann

Rote Stäbchen bedeuten, dass die Organismen Karbolfuchsin während der Behandlung mit Säurealkohol zurückgehalten haben. Dieser Befund ist mit Mycobacterium tuberculosis vereinbar. Die CDC-Leitlinien zur Tuberkulosediagnostik weisen jedoch ausdrücklich darauf hin, dass auch andere Mykobakterien säurefest sind. Die Speziesidentifizierung erfordert deshalb Kultur und Nukleinsäuretests, nicht die Beurteilung der Farbe.

Fehler bei der Durchführung treten vor allem bei den beiden Waschschritten auf. Unzureichende Entfärbung lässt Hintergrundmaterial rot zurück und begünstigt falsch positive Befunde. Zu starke Entfärbung entfernt schwach zurückgehaltenen Primärfarbstoff und trägt zu falsch negativen Ergebnissen bei. Eine zu intensive Gegenfärbung verdeckt vereinzelt vorhandene Stäbchen im blauen Hintergrund. Dicke Ausstriche, ausgefällte Reagenzien und verunreinigtes Spülwasser verursachen zusätzliche Artefakte.

Die Sensitivität ist unabhängig von der Sorgfalt der Durchführung durch die Erregerzahl begrenzt. Die konventionelle Ausstrichmikroskopie benötigt ungefähr 5,000 bis 10,000 Stäbchen pro Milliliter Sputum. Ältere Evidenzübersichten der CDC bezifferten die Sensitivität der Ausstrichmikroskopie bei kulturell bestätigten pulmonalen Fällen auf etwa 45 bis 80 Prozent. Ein negativer Ausstrich schließt Tuberkulose daher niemals aus. Die aktuellen CDC-Leitlinien sehen zu jedem Ausstrich auch eine Kultur vor und empfehlen einen Nukleinsäureamplifikationstest an mindestens einer Atemwegsprobe, wenn eine Lungentuberkulose in Betracht gezogen wird und das Ergebnis das weitere Vorgehen verändern würde.

Praktische Arbeit richtet sich nach autorisierten Protokollen

Lehrtexte, einschließlich dieses Artikels, berechtigen nicht zur Durchführung klinischer Laborarbeit. Befolgen Sie bei der praktischen Laborarbeit die validierte Standardarbeitsanweisung des Labors, die auf aktuelle Dokumente von CDC, APHL oder CLSI abgestimmt ist. Die im Stacks-Archiv hinterlegte CDC-Referenz zur Färbung säurefester Bakterien zeigt, wie solche Verfahren Reagenzien und Befundkriterien festlegen. Die Arbeit mit Tuberkuloseproben erfordert Schutzmaßnahmen zur Eindämmung: Ausstriche werden in einer mikrobiologischen Sicherheitswerkbank hergestellt, weil dabei Aerosole und Spritzer entstehen. Die CDC-Leitlinien zur Laborsicherheit halten fest, dass selbst hitzefixierte Ausstriche lebensfähige Tuberkulosebakterien enthalten können und weiterhin als kontaminiert behandelt werden müssen. Der Eintrag der CDC Public Health Image Library zu einem mit Karbolfuchsin und Methylenblau gefärbten, auf M. leprae untersuchten Ausstrich erinnert daran, dass die Methode über Tuberkulose hinaus eingesetzt wird: Derselbe Rot-Blau-Kontrast dient überall dort, wo nach säurefesten Organismen gesucht wird. Auch ein sorgfältig erhobener negativer Befund ist ein Ergebnis, das dokumentiert werden sollte.

Den fertig gefärbten Objektträger beurteilen

Die Gegenfärbung erfüllt ihre Aufgabe beim Durchmustern des Präparats. Eine mikroskopierende Fachkraft nutzt bei geringer Vergrößerung zunächst den blauen Hintergrund, um die Qualität des Ausstrichs zu beurteilen: gleichmäßige Zellverteilung, intakte Wirtszellen zur Fokussierung, keine starken Ausfällungen. Rote Kandidaten fallen dann gerade deshalb auf, weil sonst nichts auf dem Objektträger rot ist. Die Bestätigung erfolgt unter Ölimmersion. Dort zeigen echte Bakterien die erwarteten dünnen, manchmal leicht gebogenen oder perlschnurartigen Stäbchen und unterscheiden sich dadurch von gleichförmigen Farbstoffpartikeln.

Die Hintergrundfärbung bestimmt auch die Formulierung des Befunds. Bei einem Objektträger mit roten Stäbchen lautet der Befund: säurefeste Stäbchen nachgewiesen, häufig ergänzt durch eine semiquantitative Einstufung nach der Skala des Labors. Bei einem Objektträger ohne rote Organismen lautet er: keine säurefesten Stäbchen nachgewiesen, niemals: negativ auf Tuberkulose. Diese Unterscheidung ist entscheidend, weil das blaue Gesichtsfeld belegt, dass die Färbung funktioniert hat, die Zellen den Gegenfarbstoff aufgenommen haben und die optischen Bedingungen ausreichend waren. Über Organismen unterhalb der Nachweisgrenze sagt es dagegen nichts aus. Ein blaues Gesichtsfeld ohne rote Stäbchen ist ein gültiges Ergebnis für den Objektträger, kein Urteil über den Patienten.

Wenn Sie die Aufgabenverteilung beachten, ergibt sich die Befundformulierung von selbst. Karbolfuchsin macht Kandidaten sichtbar. Säurealkohol führt die eigentliche Prüfung durch. Methylenblau macht die Antwort lediglich ablesbar: Rot hat den Farbstoff trotz Säure zurückgehalten, Blau hat ihn verloren. Alles Weitere, Spezies, Erregerzahl und klinische Bedeutung, ergibt sich aus Untersuchungen, die über den Objektträger hinausgehen.