Mitochondriale Effekte von Methylenblau messen: Sauerstoff, ATP und Membranpotenzial

Angenommen, ein Labor gibt Methylenblau zu Mitochondrien mit beeinträchtigter Atmung und beobachtet einen Anstieg des Sauerstoffverbrauchs. Die naheliegende Formulierung lautet, dass der Farbstoff die mitochondriale Funktion wiederhergestellt hat. Diese Aussage kann falsch sein. Sauerstofffluss, ATP-Synthese und Membranpotenzial sind drei unterschiedliche Konzepte. Sie betreffen dasselbe Organell, ähnlich wie Sicherung, Synchronisierung und Freigabe denselben Cloud-Ordner betreffen: Sie hängen zusammen, folgen aber unterschiedlichen Regeln. Wer sie verwechselt, gelangt zu einer falschen Interpretation, selbst wenn jede Messung technisch korrekt ist.

Methylenblau begünstigt diese Verwechslung, weil es selbst an dem System beteiligt ist, das untersucht wird. Es durchläuft Redoxzyklen, indem es weiter vorn im Elektronentransport Elektronen aufnimmt und sie weiter hinten abgibt. Es ist ein lipophiles Kation, das sich in energetisierten Mitochondrien anreichert, und eine intensiv blaue Verbindung, die Licht in denselben Spektralbereichen wie gängige Sonden absorbiert und emittiert. Eine einzelne Messgröße kann all diese Einflüsse nicht abbilden. Das verlässliche Vorgehen, das die Budapester Mitochondrienstudien zeigen, besteht darin, Sauerstofffluss, ATP-Syntheserate, Membranpotenzial und Wasserstoffperoxidfreisetzung zu messen, jeweils mit farbstoffspezifischen Kontrollen.

Respirometrie misst den Sauerstofffluss, nicht die Energieausbeute

Hochauflösende Respirometrie, ob mit einem Oroboros Oxygraph oder einem Seahorse-Analysator für extrazelluläre Flüsse, erfasst eines: wie schnell Sauerstoff reduziert wird. Sie erfasst nicht, wie viele Protonen pro Elektron gepumpt wurden, wie viel des Gradienten erhalten blieb oder ob die ATP-Synthase ihn genutzt hat.

Die Terminologie ist entscheidend. Bei isolierten Mitochondrien ergibt Substrat ohne ADP die Leckatmung, Substrat mit sättigendem ADP die Kapazität der oxidativen Phosphorylierung und eine Entkopplertitration die maximale Elektronentransferkapazität. Bei intakten Zellen sind die entsprechenden Seahorse-Messgrößen die Basalatmung, die oligomycinempfindliche ATP-gekoppelte Atmung, das Protonenleck, die durch FCCP bestimmte maximale Atmung und der gegenüber Rotenon plus Antimycin resistente nichtmitochondriale Sauerstoffverbrauch. Seahorse-Ergebnisse als State 3 und State 4 zu bezeichnen, suggeriert eine Präzision, die das Präparat nicht ermöglicht, wie das Agilent-Konzept für den Mito Stress Test verdeutlicht.

Methylenblau durchbricht die intuitive Verbindung zwischen mehr Sauerstoff und mehr Energie. In isolierten Hirnmitochondrien von Meerschweinchen erhöhte der Farbstoff bei 100 nM bis 1 uM den Sauerstoffverbrauch im Ruhezustand mit den Substraten Glutamat plus Malat, Succinat und Alpha-Glycerophosphat. Mit Alpha-Glycerophosphat betrug der Anstieg etwa 64 Prozent. Die ADP-stimulierte Atmung gesunder Mitochondrien blieb dagegen im Wesentlichen unverändert, wie die Studie an isolierten Hirnmitochondrien berichtet. Weil die Leckatmung zunahm, während der ADP-stimulierte Fluss konstant blieb, sank der berechnete respiratorische Kontrollquotient. Dieser Rückgang bedeutet nicht, dass der Farbstoff die Mitochondrien geschädigt hat. Er bedeutet, dass der Farbstoff der normalen Atmung einen zusätzlichen sauerstoffverbrauchenden Redoxzyklus überlagert hat. Ein Assay zum Sauerstoffverbrauch unter Methylenblau, der nur den Anstieg erfasst, hat reale chemische Vorgänge gemessen, aber nichts über die Energiekonservierung ausgesagt.

Die Versuche zur Wiederherstellung der Funktion zeigen dieselbe Diskrepanz in größerem Ausmaß. Bei blockiertem Komplex I stieg der Sauerstofffluss etwa auf das Dreifache, die ATP-Synthese dagegen nur etwa auf das 1.5-Fache. Mehr Sauerstoff erreichte die Elektrode. Ein geringerer Anteil davon trug zur ATP-Bildung bei. Jede Aussage über eine verbesserte oxidative Phosphorylierung benötigt auch die ATP-Seite der Bilanz, idealerweise als Verhältnis von ATP zu Sauerstoff mit einer Angabe dazu, wie der Nenner definiert ist.

ATP-Assays messen die Syntheserate, die sich nicht durch den ATP-Gehalt ersetzen lässt

Ein ATP-Assay beantwortet eine andere Frage: Wie viel ATP wird pro Zeiteinheit gebildet? Eine kinetische Messung liefert eine Rate, entweder über die über Minuten verfolgte Lumineszenz der Glühwürmchen-Luciferase oder über einen gekoppelten Assay mit Hexokinase plus Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase bei 340 nm. Eine einzelne Endpunktmessung des gesamten ATP liefert dagegen einen Gehalt. Dieser spiegelt Synthese minus Verbrauch wider und sagt für sich genommen wenig über die oxidative Phosphorylierung aus.

Die Budapester Gruppe verwendete die gekoppelte enzymatische Methode bei unterdrückter Adenylatkinaseaktivität. Sie stellte fest, dass Methylenblau bei 1 bis 2 uM die ATP-Produktion in mit Rotenon und mit Antimycin behandelten Mitochondrien geringfügig, aber signifikant erhöhte. Das ist eine tatsächliche, jedoch nur teilweise Wiederherstellung. Die Studie zur TEGDMA-Toxizität ergab in einem anderen Modell ein ähnliches Bild: 5 mM des Dentalmonomers TEGDMA ließen die an Komplex I gekoppelte Atmung von etwa 286 auf 28 Flusseinheiten einbrechen, und 2 uM des Farbstoffs erhöhten sie wieder auf etwa 86.

Bei einer farbigen redoxaktiven Verbindung sind zwei Kontrollen unverzichtbar. Erstens muss mit Oligomycin bestimmt werden, welcher Anteil der gemessenen ATP-Synthese von der ATP-Synthase abhängt. Zweitens ist ein zellfreier Aufstockungsversuch zur Wiederfindung mit einer bekannten ATP-Menge, dem vollständigen Reagenz und genau den verwendeten Farbstoffkonzentrationen erforderlich, mindestens 0, 100 nM, 300 nM, 1 uM und 2 uM. Der Farbstoff kann emittiertes Licht absorbieren, das Reporterenzym hemmen oder die Redoxchemie der Reagenzien verändern. Allgemeine Hinweise zu Luciferase-Assays empfehlen biochemische Gegenprüfungen genau für diese Art von Interferenz. Gehen Sie nicht davon aus, dass 1 uM frei von Artefakten ist, nur weil Quenching bei höheren Konzentrationen meist stärker ausfällt.

Membranpotenzialsonden messen die Farbstoffverteilung, nicht den Fluss

Safranin O, TMRM und TMRE, Rhodamin 123 und JC-1 sind allesamt membrangängige Kationen. Sie reichern sich entsprechend dem elektrochemischen Gleichgewicht in der negativ geladenen Matrix an. Die Gesamtfluoreszenz erfasst das Potenzial daher indirekt über die Verteilung der Sonde. Keine dieser Sonden misst ATP oder den Elektronenfluss.

Jede Sonde eignet sich bevorzugt für ein bestimmtes Präparat. Safranin O eignet sich für isolierte Mitochondrien und permeabilisierte Zellen, typischerweise bei etwa 2 uM mit einer Anregung bei etwa 495 nm und einer Emission bei etwa 585 nm. Es wird im Quenching-Modus eingesetzt, bei dem die Aufnahme die Gesamtfluoreszenz verändert. TMRM und TMRE eignen sich für intakte Zellen bei niedriger Beladung im nanomolaren Bereich im Modus ohne Quenching. Bei einer Depolarisierung wird der Farbstoff freigesetzt, und die mitochondriale Fluoreszenz sinkt. Bei hoher Beladung kann sich die Signalrichtung durch Selbstquenching umkehren. JC-1 liefert ein praktisches Verhältnis von grüner zu roter Fluoreszenz, ist aber von der Beladung und der mitochondrialen Masse abhängig. Dadurch ist es für quantitative Untersuchungen weniger geeignet als sorgfältig kontrolliertes TMRM. Diese Abwägungen sind in einer häufig verwendeten Übersichtsarbeit zu Sonden für das mitochondriale Membranpotenzial zusammengefasst.

Methylenblau verursacht genau bei den verwendeten Arbeitskonzentrationen optische Interferenzen. Seine Absorptionsbanden bei etwa 600 bis 665 nm überlappen mit der roten Sondenemission. Innerfiltereffekte, Quenching und die Absorption von Anregungslicht sind daher plausible Störeinflüsse. Der Farbstoff ist außerdem ein zweites lipophiles Kation, dessen eigene Verteilung sich mit dem gemessenen Potenzial verändert. Abhilfe schaffen redundante Messungen und Leerproben: Sonde allein, Farbstoff allein, Sonde plus jede Farbstoffkonzentration, vollständige Depolarisierung mit FCCP als Nullreferenz und idealerweise eine zweite, optisch unterschiedliche Sonde. Die Studie zur Umgehung von Komplex III lieferte dafür ein Beispiel: Sie untersuchte die Wiederherstellung des Membranpotenzials nach Hemmung mit Antimycin und Myxothiazol sowohl mit Safranin O als auch mit TMRM und erhielt mit beiden dieselbe qualitative Erholung. Ein optischer Reporter liefert einen Hinweis. Zwei unabhängige Reporter liefern Evidenz.

Drei Präparate, drei unterschiedliche Fragen

Isolierte Mitochondrien, permeabilisierte Zellen und intakte Zellen sind keine austauschbaren Empfindlichkeitseinstellungen desselben Assays. Sie sind unterschiedliche Untersuchungsmodelle mit unterschiedlichen Funktionsprinzipien.

Isolierte Mitochondrien behalten die Elektronentransportkette, die innere Membran und den Funktionsapparat der Matrix, während Plasmamembran, Zytosol und Netzwerkarchitektur entfernt werden. Genau diese Entfernung ist beabsichtigt: Substrate, ADP, Inhibitoren und Farbstoffkonzentrationen sind exakt definiert, sodass sich ein Reaktionsweg zuordnen lässt. Der Preis dafür ist der Verlust der natürlichen Substratversorgung, Signalübertragung und Bedarfsregulation.

Permeabilisierte Zellen behalten die Mitochondrien innerhalb eines großen Teils ihrer zellulären Architektur, während exogene Substrate und ADP durch die geöffnete Plasmamembran gelangen. Sie eignen sich dafür, einen Defekt eines substratabhängigen Reaktionswegs im zellulären Kontext zuzuordnen. Eine übermäßige Permeabilisierung schädigt die äußere Membran, und die zytosolische Regulation wird ausgewaschen.

Intakte Zellen erhalten alles: die Barriere der Plasmamembran, zytosolische Reduktionsmittel, den endogenen Substrattransport, das mitochondriale Netzwerk und den ATP-Bedarf. Sie liegen der Physiologie am nächsten und erlauben die geringste mechanistische Zuordnung, weil Aufnahme, Reduktion und Sequestrierung des Farbstoffs die wirksame Exposition der Mitochondrien mitbestimmen.

Die TEGDMA-Studie setzte alle drei Ebenen gezielt ein: isolierte Hirnmitochondrien zur Untersuchung der farbstoffbedingten Wiederherstellung von Oxidation und Potenzial, permeabilisierte Stammzellen aus der Zahnpulpa hauptsächlich zur Zuordnung der Schädigung zur an Komplex I gekoppelten Substratoxidation und intakte Stammzellen zur Untersuchung des physiologischen Nettoeffekts von 2 uM Farbstoff auf den verminderten Sauerstoffverbrauch. Für Leser, die mitochondriale Messgrößen verschiedener Präparate vergleichen, erläutert der begleitende Beitrag zum Elektronentransport durch Methylenblau in der Atmungskette die beteiligten Reaktionswege. Der Leitfaden zur Interpretation von Atmungsstudien mit Methylenblau behandelt die Logik von Konzentrationen und Inhibitoren.

Kontrollen, die ein redoxaktiver Farbstoff erfordert

Eine Verbindung, die Redoxzyklen durchläuft, benötigt mehr Kontrollen als ein gewöhnlicher Inhibitor, weil chemische Vorgänge des Farbstoffs allein biologische Prozesse nachahmen können.

Verwenden Sie für die Respirometrie eine Kammer nur mit Puffer zur Erfassung der Drift, eine Kammer mit Puffer plus Farbstoff ohne biologisches Material sowie Farbstoff plus jedes im Assay vorhandene extrazelluläre Reduktionsmittel. Geben Sie bei intakten Zellen am Ende Rotenon plus Antimycin hinzu, um den nichtmitochondrialen Sauerstoffverbrauch zu bestimmen. Beachten Sie, dass der reduzierte Farbstoff reoxidiert wird, indem er Elektronen auf Sauerstoff überträgt und dabei Wasserstoffperoxid bildet. Eine Leerprobe nur mit Farbstoff und ohne Elektronendonor unterschätzt daher den zellfreien Sauerstoffverbrauch, der auftritt, sobald NADH oder NADPH verfügbar ist.

Verwenden Sie für Wasserstoffperoxid bevorzugt kalibriertes Amplex UltraRed plus Meerrettichperoxidase statt nichtselektiver DCFDA-Farbstoffe. Verifizieren Sie die Messung mit Katalase und prüfen Sie die Abhängigkeit von der Beleuchtung, da der Farbstoff ein Photosensibilisator ist. Die Studie an Hirnmitochondrien ergab, dass die Peroxidbelastung bereits bei 100 nM Farbstoff auf mehr als das Vierfache anstieg, während die Eliminierung langsamer wurde. Das Peroxid entstand direkt durch den reduzierten Farbstoff ohne Superoxid als Zwischenprodukt. Einzelheiten zur Sondenauswahl und zu Lichtkontrollen behandelt der begleitende Beitrag zur Messung reaktiver Sauerstoffspezies in Farbstoffexperimenten. Die weiterführende Frage, wann Peroxid als Signal und wann als Belastung wirkt, wird im Zusammenhang mit dem zellulären Redoxgleichgewicht und Aussagen zu Antioxidantien behandelt.

Prüfen Sie für Aussagen zu Reaktionswegen beide Hemmstellen von Komplex III: Antimycin A an der Qi-Stelle und Myxothiazol an der Qo-Stelle, ergänzt durch einen Endpunkttest an Komplex IV mit Cyanid. Eine frühere Studie an Mäusehirnen berichtete, dass der Farbstoff die durch Rotenon blockierte Atmung wiederherstellte, die durch Antimycin blockierte Atmung jedoch nicht. Die spätere Studie mit drei Spezies fand dagegen eine teilweise Wiederherstellung bei beiden Inhibitoren und Hinweise auf eine direkte Reduktion von Cytochrom c. Betrachten Sie die Umgehung als mit den neueren Daten vereinbar, aber noch nicht als abschließend geklärt. Farbstoffkonzentration, Hemmstelle, Substratzustand und Farbstoffverteilung verändern jeweils den beobachteten Reaktionsweg.

Matrix zur Assay-Auswahl

Wählen Sie mithilfe dieser Tabelle die Messung anhand der Fragestellung aus, nicht umgekehrt.

Für eine mindestens überzeugende Aussage müssen dieselben Farbstoffkonzentrationen, 100 nM, 300 nM, 1 uM und 2 uM, in allen Messungen eingesetzt werden: Sauerstofffluss unter Leckatmungs-, ADP-, Oligomycin- und Entkopplerbedingungen, ATP-Syntheserate, Membranpotenzial mit vorzugsweise zwei Sonden sowie kalibrierte Peroxidfreisetzung mit Katalase und zellfreien Kontrollen. Berichten Sie die zusammengehörigen Messgrößen: Sauerstofffluss plus ATP-Rate plus ATP pro Sauerstoff plus Potenzial plus Peroxid. Jede dieser Zahlen für sich ist eine Messung, deren Bedeutung noch geklärt werden muss.