Messung reaktiver Sauerstoffspezies in Methylenblau-Experimenten

Zwei Labore führen jeweils ein Experiment durch, das sie als Untersuchung der antioxidativen Wirkung von Methylenblau bezeichnen. Das eine berichtet, dass der Farbstoff reaktive Sauerstoffspezies unterdrückt. Das andere berichtet, dass er sie erzeugt. Beide zeigen saubere Dosis-Wirkungs-Kurven. Beide berichten nach bestem Wissen. Der Unterschied liegt weder in Betrug noch in mangelnder Kompetenz. Die beiden Gruppen haben unter unterschiedlicher Beleuchtung unterschiedliche Dinge gemessen, mit Sonden, die unterschiedliche Fragen beantworten. Anschließend haben sie beide Antworten mit demselben Wort beschrieben: ROS.

Methylenblau lässt sich gerade deshalb schwer präzise messen, weil es an der Chemie beteiligt ist, die es beobachten soll. Im Dunkeln transportiert es Elektronen zwischen Donoren und Akzeptoren und kehrt in seine Ausgangsform zurück, bereit für den nächsten Zyklus. Unter Lichteinwirkung wird es zum Photosensibilisator und erreicht einen angeregten Triplettzustand. Aus diesem Zustand kann es Energie auf Sauerstoff übertragen und so Singulett-Sauerstoff bilden oder Elektronen übertragen und dadurch Radikale und Wasserstoffperoxid erzeugen. Jede Sonde, die in dieses System eingebracht wird, kann durch den Farbstoff selbst oxidiert, reduziert, gebleicht oder optisch maskiert werden. Deshalb lautet die erste Frage bei jeder ROS-Messung nie, wie hoch der Messwert ist. Sie lautet, was der Assay tatsächlich nachweist und wie der Farbstoff den Assay beeinflusst.

Amplex Red: ein kalibrierter Wasserstoffperoxid-Assay

Die Kombination aus Methylenblau und Amplex Red ist bei korrektem Versuchsaufbau die methodisch am besten begründete Kombination in dieser Literatur. Die Chemie ist spezifisch: Meerrettichperoxidase nutzt Wasserstoffperoxid, um das Amplex-Substrat mit einer Stöchiometrie von ungefähr eins zu eins zu einem fluoreszierenden Produkt, Resorufin, zu oxidieren. Peroxid aus der Probe wird so im Detektor als Fluoreszenz erfasst. Keine andere Spezies aus der klassischen ROS-Gruppe treibt diese Reaktion direkt an.

Der entscheidende Vorteil ist die Kalibrierung. Wer sorgfältig arbeitet, misst Peroxidstandards bekannter Konzentration im selben Puffer, mit denselben Peroxidase- und Substratkonzentrationen, derselben Inkubationszeit und denselben optischen Einstellungen und wertet die Proben anschließend anhand dieser Kurve aus. In der Studie mit isolierten Hirnmitochondrien, auf der diese Methode beruht, taten die Autoren genau das: Sie gaben am Ende jedes Durchlaufs bekannte Peroxidmengen zu und berichteten die Werte als Raten in Pikomol pro Minute und Milligramm Protein statt in willkürlichen Fluoreszenzeinheiten. Erst dadurch wird aus einem Leuchten eine Messung.

Drei Details dieser Studie sollten übernommen werden. Erstens überprüften die Autoren das Signal mit Katalase, die Peroxid abbaut. Der durch Methylenblau ausgelöste Fluoreszenzanstieg stoppte nach Zugabe von Katalase. Das bestätigte, dass das Signal auf Peroxid und nicht auf einem optischen Artefakt beruhte. Zweitens prüften sie den Einfluss der Beleuchtung direkt, indem sie den Anregungsstrahl mit einem Verschluss so unterbrachen, dass die Proben nur ein Achtel der normalen Lichtdosis erhielten. Das Signal sank dabei lediglich um neun Prozent. Mehr als neunzig Prozent des von ihnen gemessenen Peroxids entstanden unabhängig vom Messlicht. Drittens maßen sie den Peroxidabbau separat mit einer Elektrode und stellten fest, dass der Farbstoff sowohl die Produktion erhöhte als auch den Abbau verlangsamte. Eine Sonde, die nur die Nettofluoreszenz erfasst, hätte diese beiden Effekte vermischt.

Der Assay hat dennoch Fehlerquellen, und Methylenblau macht mehrere davon relevant. Der Farbstoff absorbiert über einen breiten Bereich derselben roten Spektralregion, in der Resorufin emittiert. Bei hohen Farbstoffkonzentrationen kann die Probe deshalb ihr eigenes Signal durch innere Filtereffekte maskieren. Standards sollten daher dieselbe Farbstoffkonzentration enthalten wie die Proben. Amplex Red kann außerdem selbst photooxidieren, und sein Produkt Resorufin kann an Photoredoxzyklen teilnehmen, die Superoxid und Peroxid erzeugen. Das ist besonders relevant, wenn im Experiment zusätzlich ein Photosensibilisator beleuchtet wird. Die praktische Lösung besteht darin, zunächst die Methylenblau-Proben zu bestrahlen und anschließend Aliquote mit Amplex-Reagenzien im Dunkeln zu untersuchen, statt Farbstoff und Sonde gemeinsam zu beleuchten. Schließlich unterdrückt Superoxiddismutase ein Amplex-Signal nicht einfach: Die Umwandlung von Superoxid zu Peroxid kann es erhöhen. Eine SOD-Kontrolle, bei der die Fluoreszenz steigt, ist nicht fehlgeschlagen. Sie hat Superoxid als vorgelagerte Spezies identifiziert.

DCFDA: ein unspezifischer Oxidationsindikator

Die Kombination aus Methylenblau und DCFDA ist die Ursache für einen Großteil der Verwirrung. DCFH-DA ist eine Vorstufe, die in Zellen aufgenommen wird. Esterasen im Zellinneren spalten seine Acetatgruppen ab, sodass nicht fluoreszierendes DCFH zurückbleibt. Durch Oxidation von DCFH entsteht fluoreszierendes DCF. Die Liste der Stoffe, die es oxidieren, ist lang: Hydroxylradikale, Peroxidase- und Häm-Zwischenprodukte, Stickstoffdioxid, hypochlorige Säure und aus Peroxynitrit entstehende Radikale. Wasserstoffperoxid allein oxidiert es nicht direkt mit einer für Messungen brauchbaren Geschwindigkeit. Peroxidabhängige Fluoreszenz setzt im Allgemeinen die Beteiligung von Eisen, Hämproteinen oder Peroxidasereaktionen voraus.

Die Kritik, die jeder Methodenteil zitieren sollte, stammt aus der Analyse von DCFH als Sonde durch Kalyanaraman und Kollegen. Sie wird in der Studie mit Hirnmitochondrien zusammengefasst, die DCFDA aus diesem Grund verwarf. Diese Analyse zeigte, dass die Sonde langsam, mit nicht charakterisierter Stöchiometrie, ohne gültige Kalibrierung und auch mit Verbindungen reagiert, die keine ROS sind. Die Sonde verstärkt zudem das, was sie misst: Die Einelektronenoxidation von DCFH erzeugt ein DCF-Radikal, das mit Sauerstoff reagiert und Superoxid bildet. Dieses dismutiert zu zusätzlichem Peroxid. Die Messung erzeugt also teilweise selbst die Chemie, über die sie Auskunft gibt.

All das macht DCFDA nicht nutzlos. Es macht die Sonde zu einem Screening-Werkzeug, nicht zu einem Mittel zur Identifizierung. Ein Anstieg der DCF-Fluoreszenz bedeutet, dass die oxidantienabhängige Oxidation der Sonde zugenommen hat. Er bedeutet nicht, dass Peroxid zugenommen hat, und erst recht nicht, dass die Gesamtmenge an ROS gestiegen ist. Diese Größe lässt sich mit keiner einzelnen Sonde messen. Frühere Arbeiten zu Methylenblau, die sich bei Konzentrationen über einem Mikromolar auf die DCF-Oxidation stützten, berichteten prooxidative Effekte. Andere Systeme aus derselben Zeit zeigten dagegen einen Schutz vor peroxidinduziertem Zelltod. Beide Beobachtungen können für denselben Farbstoff in unterschiedlichen Redoxumgebungen zutreffen, und das DCF-Ergebnis allein kann nicht zeigen, welches Oxidationsmittel das Signal verursacht hat. Die Bedeutung der früheren Arbeit mit Hirnmitochondrien liegt darin, dass sie dieses Screening durch eine kalibrierte Peroxidmessung ersetzte und die Belastung direkt erfasste: Schon einhundert Nanomolar Farbstoff erhöhten die Peroxidfreisetzung bei jedem untersuchten Substrat und Atmungszustand um ein Mehrfaches.

DCFDA birgt noch eine weitere, für Methylenblau spezifische Falle. Der Farbstoff ist intensiv gefärbt und redoxaktiv. Daher kann er die Fluoreszenz bleichen, die Emission löschen oder die Sonde unabhängig von zellulären ROS oxidieren. Eine zellfreie Kontrolle mit Farbstoff und Sonde, aber ohne Zellen, ist kein optionales Beiwerk. Sie ist das Experiment, das zeigt, ob der Farbstoff mit der Sonde wechselwirkt.

Spin-Trapping und Sauerstoffaufnahme: Identität und Umsatzrate

Während fluoreszierende Sonden anzeigen, dass etwas oxidierendes entstanden ist, liefert die Elektronenspinresonanz mit Spinfallen einen näheren Hinweis darauf, was es war. Die klassische Studie zur Photochemie von Methylenblau nutzte ESR zum Nachweis des Ascorbatradikals aus Farbstoff, Ascorbat und Licht. Anschließend wies sie in Experimenten zur Sauerstoffaufnahme die Peroxidbildung und in Spin-Trapping-Versuchen die eisenkatalysierte Bildung von Hydroxylradikalen nach. Jede Technik beantwortete eine Frage, die die anderen nicht beantworten konnten: ESR lieferte die Radikalidentität, die Sauerstoffaufnahme lieferte die Reaktionsumsatzrate unabhängig von jeder fluoreszierenden Sonde, und die Kombination zeigte, dass im selben beleuchteten System sowohl Singulett-Sauerstoff- als auch Radikalreaktionswege aktiv waren.

Das Ergebnis von 1984 liest sich noch immer wie ein Warnhinweis. Bei Beleuchtung und in Gegenwart eines Reduktionsmittels erzeugte der Farbstoff Peroxid. In Gegenwart von Eisen produzierte das System außerdem das Hydroxylradikal, die reaktivste Spezies dieser Gruppe. Die Autoren stellten einen Zusammenhang mit Ascorbat im Auge her und hinterfragten den unbedachten Einsatz in der Augenheilkunde. Heutige Leser sollten die Bedingungen beachten: Licht plus Reduktionsmittel plus Eisen. Wird einer dieser Faktoren entfernt, schwächt sich der Reaktionsweg ab oder entfällt.

Sauerstoffelektroden haben aus einem anderen Grund ihren Platz. Eine Clark-Elektrode misst den Nettosauerstoffverbrauch. Damit lässt sich feststellen, dass die vom Farbstoff angetriebene Redoxchemie molekularen Sauerstoff verbraucht. Sie liefert außerdem kinetische Daten, die kein Fluoreszenzartefakt vortäuschen kann. Das Produkt identifiziert sie nicht. Die Bildung von Peroxid, Superoxid und Wasser sowie der Zerfall von Singulett-Sauerstoff verbrauchen jeweils Sauerstoff. Eine Umsatzrate ohne Identität ist ebenso unvollständig wie eine Identität ohne Umsatzrate. Deshalb kombinieren methodisch überzeugende Arbeiten die Elektrode mit einem kalibrierten Peroxid-Assay oder einer Spin falle.

Warum Ergebnisse zur antioxidativen Wirkung widersprüchlich sind

Stellt man die drei Messansätze nebeneinander, lassen sich die scheinbaren Widersprüche in der Methylenblau-Literatur auf methodische Unterschiede und drei biologische Tatsachen zurückführen.

Erstens ist der Farbstoff sowohl ein Elektronentransporter als auch eine Peroxidquelle. Indem er Elektronen von den Stellen der Atmungskette weglenkt, an denen Sauerstoff sonst zu Superoxid würde, kann er eine ROS-Spezies vermindern. Gleichzeitig kann seine reduzierte Form Sauerstoff direkt zu Peroxid reduzieren und so eine andere ROS-Spezies erhöhen. Ein Labor, das sich mit mitochondrialer Redoxchemie und der Umgehungsfunktion von Methylenblau beschäftigt, sollte daher sondenabhängige Antworten erwarten: Ein superoxidempfindliches Signal sinkt, während ein Peroxidsignal in derselben Küvette steigt.

Zweitens ist Peroxid in niedrigen Dosen ein Signal und nicht nur eine Schadensquelle. Die auf die frühere Arbeit folgende Studie mit Hirnmitochondrien von Mäusen zeigte eine Peroxidbildung bereits ab fünfzig Nanomolar Farbstoff ohne Schädigungen der mitochondrialen DNA bei therapeutischen Konzentrationen sowie nach Vorbehandlung einen Schutz vor rotenoninduzierten Schädigungen. Erst bei einhundert Mikromolar, weit oberhalb des therapeutischen Bereichs, schädigte der Farbstoff ausgewählte DNA-Fragmente. Rotes Licht in Kombination mit zwanzig Mikromolar Farbstoff erzeugte dagegen Singulett-Sauerstoff, der alle untersuchten Fragmente schädigte. Der vorgeschlagene Mechanismus ist hormetisch: Eine geringe Peroxidproduktion löst Nrf2-assoziierte antioxidative Abwehrmechanismen und mitochondriale Biogenese aus, sodass ein kurzfristig prooxidativer Messbefund einem längerfristig antioxidativen Ergebnis vorausgeht. Ein nach einer Stunde ausgewerteter Assay und ein nach einem Tag ausgewerteter Assay können unterschiedliche Ergebnisse liefern, weil sich die biologischen Vorgänge dazwischen verändert haben.

Drittens entscheidet das Licht darüber, welches Molekül überhaupt vorliegt. Beleuchtung demethyliert den Farbstoff in Richtung Azure B und verwandter Produkte, und schon die Mikroskoplampe über einer Kulturschale reicht aus, um seine photosensibilisierende Wirkung auszulösen. Experimente im Dunkeln und unter Beleuchtung sind unterschiedliche Experimente. Der Abschnitt zu Kontrollen für Beleuchtung und den Umgang mit dem Farbstoff in jedem Protokoll sollte sie entsprechend behandeln.

Ein Mindestumfang an Kontrollen und die Bewertung von Aussagen

Der folgende Vergleich ist die eigens für diesen Artikel erstellte Referenzübersicht. Bevor Sie ein ROS-Ergebnis zu Methylenblau akzeptieren, prüfen Sie, welche Zeilen die Autoren abgedeckt und welche sie ausgelassen haben.

Daraus ergibt sich eine praktische Regel für die Interpretation. Amplex mit Peroxidase, kalibriert und mit einer Katalasekontrolle, liefert Evidenz zu Peroxid. DCFDA liefert Evidenz zur unspezifischen Sondenoxidation und zu nichts darüber hinaus. Spin-Trapping mit Radikalfängerkontrollen liefert Evidenz zur Radikalidentität. Sauerstoffaufnahme liefert Evidenz zur Umsatzrate. Ein Satz, der mehr behauptet, als sein Assay belegen kann, ist unabhängig davon, wie selbstsicher er formuliert ist, eine Aussage über die Sonde und nicht über den Farbstoff. Ergänzende Erörterungen zur Dosisabhängigkeit und zum hormetischen Bereich, zum mitochondrialen Elektronenfluss, zu Assay-Interferenzen in gefärbten Proben und zu Artefakten durch Mikroskopbeleuchtung vertiefen diese Punkte. Jeder davon bleibt gültig, sobald seine Platzhalterreferenz ersetzt wird.