Loefflers alkalische und polychrome Methylenblau-Färbelösungen erklärt

Auf einem Färbeplatz können drei Flaschen nebeneinander stehen, deren Etiketten jeweils eine Variante von Methylenblau nennen. Auf einer steht wässriges Methylenblau 1%. Auf einer steht Loefflers alkalisches Methylenblau. Auf einer steht polychromes Methylenblau. Unter Zeitdruck greift eine Laborkraft zur nächststehenden Flasche. Der Ausstrich färbt sich anschließend zu schwach, zu gleichmäßig blau oder in unerwarteten Violetttönen, und die Ursache wird bei der Probe gesucht.

Das Problem liegt in der Rezeptur, nicht in der Probe. Die drei Lösungen enthalten verwandte Farbstoffe, beruhen aber auf unterschiedlichen Färbekonzepten. Eine enthält einen einfachen kationischen Farbstoff bei nahezu neutralem pH-Wert. Eine enthält denselben Farbstoff, dessen Färbewirkung durch Alkali verstärkt wird. Eine enthält überhaupt keinen einzelnen Farbstoff mehr, sondern ein gezielt oxidiertes Gemisch. Wer zur falschen Lösung greift, verändert damit das Färbeprinzip.

Die kurze Antwort

Einfaches wässriges Methylenblau bildet die Ausgangsbasis: etwa 1% Farbstoff in Wasser, eine einfache kationische Färbelösung für die Darstellung der Bakterienmorphologie und die allgemeine Mikroskopie. Bei Loefflers alkalischem Methylenblau wird einer mit Wasser verdünnten alkoholischen Stammlösung eine kleine, abgemessene Menge verdünnten Alkalis zugesetzt. Dadurch steigt der pH-Wert, und der kationische Farbstoff bindet stärker an saure bakterielle Strukturen. Polychromes Methylenblau ist Methylenblau, das durch Oxidation in alkalischer Lösung gezielt gereift wurde. Die Flasche enthält daher neben verbliebenem Methylenblau ein Gemisch aus demethylierten Homologen (Azur A, azure B, Azur C), Thionin und Methylenviolett. Dieses Gemisch färbt unterschiedliche Strukturen in unterschiedlichen Farbtönen.

Wenn Sie sich nur einen Satz merken: Die Alkalisierung verändert die Färbeintensität, die Polychromierung verändert die Färbefarben.

Gewöhnliches wässriges Methylenblau: der Referenzpunkt

Die einfachste Rezeptur besteht aus in Wasser gelöstem Methylenblau, üblicherweise mit 1% w/v, ohne Alkali und ohne Oxidation. Die farbgebende Spezies ist das Methylthioninium-Kation mit einem Chlorid-Gegenion, ein kleiner, planarer Phenothiazinfarbstoff, der im PubChem-Eintrag zu Methylenblau als Methylthioniniumchlorid beschrieben wird. Als Kation bindet es an das Phosphatrückgrat von Nukleinsäuren und an saure Gruppen bakterieller Zellwände. So erscheinen die Zellen blau vor einem hellen Hintergrund.

Seine Stärke ist die Vorhersagbarkeit. Zellkerne und Bakterien erscheinen blau. Der Kontrast ist mäßig. Schwer erkennbare Mikroorganismen können sich nur schwach anfärben. Genau diese Einschränkung wollte Loeffler beheben. Einen Überblick über die größere Gruppe einfacher Bakterienfärbungen, zu der diese Lösung gehört, bietet eine Übersicht zur bakteriellen Einfachfärbung. Auch hier ist die eindeutige Identifizierung des Farbstoffs wichtig: Methylblau ist ein völlig anderes Molekül, wie Methylblau im Vergleich mit Methylenblau erläutert. Eine Katalogsuche allein anhand des Farbnamens kann daher zur falschen Farbstoffklasse führen.

Loefflers alkalisches Methylenblau: derselbe Farbstoff mit stärkerer Färbewirkung

Die klassische Loeffler-Rezeptur kombiniert eine alkoholische Methylenblau-Stammlösung mit verdünntem Alkali in Wasser. Lehrbuchrezepturen sehen 0.3 g Farbstoff in 30 mL 95% Ethanol und zusätzlich 100 mL einer 0.01% wässrigen Kaliumhydroxidlösung vor (oder gleichwertig 30 mL gesättigte alkoholische Methylenblaulösung, 100 mL destilliertes Wasser und 1 mL 1% KOH). Daraus entsteht eine Gebrauchslösung mit etwa 0.3% Farbstoff bei deutlich alkalischem pH-Wert. Handelsübliche Varianten folgen demselben Prinzip. Der Katalog mikrobiologischer Färbelösungen von Thermo Fisher führt Loefflers alkalisches Methylenblau neben polychromen und wässrigen Varianten als separate Katalogartikel mit unterschiedlichen vorgesehenen Anwendungen auf.

Entscheidend ist das Alkali. Der erhöhte pH-Wert deprotoniert Carboxyl- und Phosphatgruppen im Präparat und erhöht so die Dichte negativ geladener Bindungsstellen. Zugleich hält die alkoholische Stammlösung den Farbstoff vollständig gelöst, sodass er diese Stellen in monomerer Form erreicht. Das Ergebnis ist eine schnellere und intensivere Bakterienfärbung als mit neutralem wässrigem Farbstoff, mit den vertrauten tiefblauen Stäbchen und Kokken eines routinemäßigen bakteriologischen Ausstrichs. Die Färbezeit beträgt typischerweise eine bis drei Minuten, anschließend wird mit Wasser gespült.

Die klassische Anwendung ist Corynebacterium diphtheriae, das auf Loeffler-Serumnährboden angezüchtet wurde: schlanke, häufig keulenförmige Stäbchen mit stark angefärbten metachromatischen Babes-Ernst-Granula aus gespeichertem Polyphosphat. Die Kombination von Nährboden und Färbelösung ist historisch bedingt; beide gehen auf denselben Bakteriologen zurück. Der Kontrast der Granula liefert dabei den diagnostischen Nutzen. Über die Arbeit mit Diphtheriebakterien hinaus dient die Lösung als allgemeine bakteriologische Färbelösung für Kulturausstriche, zur Darstellung der Neisseria-Morphologie in klinischen Ausstrichen und überall dort, wo eine Gram-Färbung nicht erforderlich ist, einfaches wässriges Methylenblau aber zu schwach färbt. Es handelt sich um eine monochrome Färbung. Alle sauren Strukturen nehmen einen Blauton an. Wenn ein Protokoll eine farbliche Differenzierung verlangt, reicht Alkali allein dafür nicht aus.

Ein praktischer Hinweis: Alkalische Farbstofflösungen verändern sich bei Lagerung und Aufnahme von Kohlendioxid und bilden Niederschläge. Labore setzen deshalb entweder kleinere Mengen an oder kaufen die Kataloglösung und beachten deren Haltbarkeit, statt eine alte Flasche weiterzuverwenden, die inzwischen auf jedem Objektträger Sediment hinterlässt.

Polychromes Methylenblau: ein Name, mehrere Farbstoffe

Polychromes Methylenblau geht vom selben Farbstoff aus, wird aber einer kontrollierten Oxidation in alkalischer Lösung unterzogen, die historisch als Reifung oder Polychromierung bezeichnet wird. Alterung unter alkalischen Bedingungen, Erhitzen mit Carbonat oder Oxidation mit Mitteln wie Dichromat entfernen schrittweise Methylgruppen von den Dimethylamino-Substituenten. Das Produkt ist ein Gemisch: verbliebenes Methylenblau sowie azure B (eine Methylgruppe entfernt), Azur A und Azur C (weitere Demethylierung), Thionin (vollständig demethyliert) und oxidative Nebenprodukte aus der Methylenviolett-Familie. Jede Komponente hat ihren eigenen Farbton und ihre eigene Gewebeaffinität. Deshalb färbt das Gemisch metachromatisch: Zellkerne, Granula, Muzine und Knorpel nehmen jeweils unterschiedliche blaue bis rotviolette Farbtöne an.

Dieselbe Chemie liegt den bekannten Blutfärbungen zugrunde. Frühe Forschende stellten fest, dass alkalisiertes Methylenblau die Kerne von Malariaparasiten in Violetttönen färbte. Ihre wässrigen, gereiften Lösungen waren jedoch instabil und bildeten innerhalb weniger Tage Niederschläge. Die Übersichtsarbeit zur Entwicklung der violetten Blutfärbung beschreibt, wie Malachowski und Romanowsky diesen Effekt 1891 unabhängig voneinander nutzten, wie Methanol eingeführt wurde, um den Farbstoffniederschlag zu stabilisieren und Ausstriche ohne Hitze zu fixieren, und wie Giemsa später das Gemisch auf der Grundlage abgemessener Mengen von azure B und Eosin mit Glycerin zur Stabilisierung standardisierte. Moderne Färbelösungen vom Giemsa-Typ gehen unmittelbar auf polychromes Methylenblau mit Eosin zurück, jene Kombination, die den Romanowsky-Effekt erzeugt. Einzelheiten zur Kombination mit Eosin und zur Komponente azure B finden Sie unter Färbungen vom Romanowsky-Typ und die Wechselwirkung zwischen azure B und Eosin.

Da es sich um ein Gemisch handelt, ist polychromes Methylenblau von Natur aus die am wenigsten standardisierte der drei Varianten. Das genaue Verhältnis der Farbtöne hängt vom Oxidationsverfahren und vom Ausmaß der Oxidation ab. Deshalb verkaufen Anbieter von Histologieprodukten es als eigenständiges Produkt mit eigener Leistungsprüfung und nicht als gealtertes Loeffler-Methylenblau. Typische Anwendungen sind der metachromatische Nachweis von Mastzellgranula, Muzinen und Knorpel, die Darstellung von Plasmazelldetails sowie von Helicobacter pylori in Gewebeschnitten mit polychromen Methoden vom Goodpasture-Typ. Es ist die richtige Wahl, wenn eine Differenzierung anhand der Farbe gefragt ist, und die falsche Wahl, wenn das Protokoll eine klar erkennbare monochrome Bakterienkontur verlangt.

Vergleich von Rezeptur und Verwendungszweck

Nutzen Sie die Tabelle als Entscheidungshilfe. Wenn sich das Präparat zu schwach anfärbt, ändern Sie die pH-Bedingungen und greifen Sie zu Loefflers Lösung. Wenn sich alles anfärbt, aber keine Strukturen farblich voneinander abheben, ändern Sie die Farbstoffzusammensetzung und greifen Sie zu polychromem Methylenblau. Wenn ein Loeffler-Ausstrich die Granula deutlich zeigt, die Laborleitung aber fragt, warum Zellkerne und Zytoplasma denselben Blauton haben, lautet die Antwort: Keine alkalische monochrome Färbung kann diese Differenzierung leisten. Dafür sind die polychromen Färbungen und ihre Derivate zur Blutfärbung zuständig.

Häufige Verwechslungen vermeiden

Zwei Fehler erklären den größten Teil der Verwirrung. Der erste besteht darin, Loefflers Lösung und einfaches Methylenblau als austauschbar zu behandeln, weil beide in der Flasche blau aussehen. Sie unterscheiden sich im pH-Wert und in der Färbeintensität. Wird neutraler Farbstoff eingesetzt, obwohl Loefflers Lösung vorgeschrieben ist, geht genau der Granulakontrast verloren, auf den das Protokoll ausgelegt wurde. Der zweite Fehler besteht darin, beliebiges altes oder unbeabsichtigt gealtertes alkalisches Methylenblau als polychrom anzusehen. Unkontrollierte Alterung erzeugt ein unbekanntes Gemisch unbekannter Konzentration. Echte polychrome Lösungen werden dagegen mit definierten Oxidationsverfahren hergestellt und in der Entwicklungslinie der Blutfärbungen mit abgemessenen Mengen Eosin kombiniert. Die Geschichte ist hier aufschlussreich: Die instabilen wässrigen, gereiften Lösungen der 1890er-Jahre wurden gerade deshalb durch stabilisierte methanolische Rezepturen ersetzt, weil unkontrollierte Gemische nicht reproduzierbar waren. Diese Erfahrung sollte man berücksichtigen, bevor man ein diagnostisches Präparat mit einer Lösung aus einer Flasche ungewissen Alters färbt.

Eine eindeutige Produktbezeichnung vervollständigt die Auswahl. Prüfen Sie den Katalogartikel (wässrig, Loeffler oder polychrom), den Farbstoffgehalt und die vorgesehene Anwendung anhand des Etiketts, statt sie aus der Farbe abzuleiten. Die drei Rezepturen haben einen gemeinsamen chromophoren Ursprung. Ihre Verwendungszwecke unterscheiden sich.