Methylenblåt i zebrafiskforskning: tilsætningsstof ved opdræt og eksperimentel konfunderende faktor

Vandet omkring zebrafiskeæg er ofte svagt blåt, og næsten ingen skriver ned hvorfor. Farvestoffet er methylenblåt, som tilsættes mod svamp, og de fleste protokoller behandler det som baggrund. Baggrund er det forkerte begreb her. Et bedre begreb er en uregistreret eksperimentel faktor: noget, der findes i de behandlede skåle, men ikke i kontrollerne, er farmakologisk aktivt ved de anvendte koncentrationer og kan påvirke netop de endepunkter, som forsøget måler.

Denne skelnen danner rammen for alt nedenfor. Rutinemæssig brug mod svamp ved opdræt er ét spørgsmål. Om tilsætningsstoffet er neutralt i forhold til din analyse, er et andet. Den nyere litteratur om zebrafisk besvarer det første beroligende og det andet mindre betryggende.

Hvad retningslinjerne faktisk foreskriver

Der findes ikke én fælles standard, og det er en del af problemet. Retningslinjer fra Canadian Council on Animal Care tillader 0.5 mg/L, eller 0.00005%, i transportopløsninger til æg og larver for at reducere svampevækst. Europæiske retningslinjer for forsøgsdyr beskriver embryoner i et medium, der ofte indeholder samme koncentration på 0.00005%. Cold Spring Harbors E3-opskrift angiver det dobbelte, 1 mg/L eller 0.0001%, som en ingrediens i opskriften. Over for dette står en påfaldende udeladelse: OECD's retningslinje for toksicitetstest på fiskeembryoner angiver rekonstitueret fortyndingsvand og testkemikaliet uden nogen anbefaling om methylenblåt, hverken i versionen fra 2013 eller i den senere revision. Ét laboratorium opdrætter altså zebrafiskembryoner i blåt vand med methylenblåt fra de første levetimer, mens et andet udfører den regulatoriske embryotest i klart vand, og begge kalder deres medium normalt. Enhver, der sammenligner resultater på tværs af laboratorier eller sammenlægger historiske kontroldata, overtager denne uoverensstemmelse.

Som koncentrationsmæssig baggrund svarer 0.00005% til cirka 1.56 micromolar og 0.0001% til cirka 3.13 micromolar. Det er lave tal, og det er fristende at opfatte dem som for lave til at have betydning. Studierne nedenfor afprøver netop den antagelse ved præcis disse koncentrationer.

Læsere med baggrund i akvariehold snarere end laboratoriearbejde møder det samme molekyle i en anden sammenhæng, som beskrives i akvarieguiden til methylenblåt. Kemien er den samme; gennemgangen af, hvordan farvestoffet transporterer elektroner gennem celler, forklarer, hvorfor en redoxaktiv forbindelse bliver ved med at dukke op i artikler om stofskifte. Det følgende handler specifikt om zebrafisks ægvand med methylenblåt.

Stofskifte: effekten skifter fortegn med udviklingsstadiet

Det mest oplysende studie eksponerede zebrafisk med normal udvikling fra den første levedag til 5 dage efter befrugtning og målte det oxidative stofskifte på hvert stadium, som beskrevet i den publicerede rapport om embryonernes stofskifteforsøg. Mønstret bør beskrives omhyggeligt, fordi retningen vender.

1 dag efter befrugtning steg det basale iltforbrug hos eksponerede embryoner ved begge opdrætskoncentrationer. Efter 2 dage var det mitokondrielle membranpotentiale i larvernes overfladelag forhøjet ved eksponering for 0.00005%, 0.0001% og 0.0003%. Efter 4 til 5 dage, efter klækning, var fortegnet vendt: det oxidative energiforbrug faldt, uanset om eksponeringen havde været kontinuerlig siden befrugtningen eller kun akut fra dag 3 til dag 4. Samtidig faldt mængden af transkripter for underenheder i de mitokondrielle respirationskomplekser efter både 1 og 4 dage sammen med transkripter knyttet til steroidogenese og glukoneogenese.

To yderligere observationer gør billedet tydeligere. Klækningen skete lidt tidligere ved den højere opdrætskoncentration, hvor eksponerede embryoner var foran efter 2 dage, og kontrollerne havde indhentet dem på dag 3. Og selve stressaksen så ud til at være intakt: når 5 dage gamle larver blev udsat for en stresspåvirkning i form af hvirvlende vand, steg kortisol i hele kroppen normalt i begge grupper. Farvestoffet er altså ikke en generel udviklingsgift ved disse doser, og det dæmper ikke alle fysiologiske reaktioner. Det påvirker energistofskiftet på en stadieafhængig måde: op før klækning og ned efter.

Adfærd: hvorfor to studier er uenige, og hvorfor begge kan have ret

Litteraturen om adfærd ser modstridende ud, indtil eksponeringsdesignene sammenholdes. Et sikkerhedsstudie af udvikling og adfærd eksponerede embryoner fra cirka 6 timer efter befrugtning for koncentrationer op til 10 micromolar, fornyede opløsningerne dagligt til og med dag 4 og flyttede derefter larverne til farvestoffrit medium på dag 5 og 6. Bevægelsesaktiviteten blev testet i en lys-mørke-test på dag 6. Resultatet: ingen signifikant effekt på dødelighed, klækning eller morfologi og ingen behandlingseffekt på bevægelsesaktiviteten. Forfatterne anbefalede med rimelighed 10 micromolar som en øvre grænse under deres betingelser.

En anden gruppe, med nogle af de samme forfattere som stofskiftestudiet, gennemførte eksponeringen, som den faktisk foregår ved opdræt: farvestoffet var til stede fra 2 til 3 timer efter befrugtning med daglig delvis fornyelse, og adfærden blev målt, mens eksponeringen var igangværende eller nyligt afsluttet. Ved de samme rutinekoncentrationer viste larverne reduceret bevægelsesaktivitet i en 24-timers test, som kunne reproduceres på tværs af stammer og laboratorier. Studiet af adfærdsmæssig konfundering pegede på den serotonerge tonus som forklaring på effekten, i overensstemmelse med farvestoffets kendte hæmning af monoaminoxidase. Mest afslørende var det, at embryomedium med methylenblåt maskerede den forventede bevægelsesreaktion på SSRI-præparatet fluoxetin. En screeningstest udført i blåt vand kan derfor overse en lægemiddeleffekt, som klart vand ville afsløre.

Der er ingen reel modstrid. En forbindelse kan være uden påviselig resteffekt to dage efter udvaskning i én test og stadig være aktiv, mens den er til stede i en anden. Den praktiske fortolkning er, at nulresultatet understøtter en øvre koncentrationsgrænse, ikke en påstand om neutralitet. Det positive resultat beskriver derimod den relevante risiko: aktiv eksponering i måleperioden under netop de betingelser, som de fleste laboratorier bruger.

Et redoxfarvestof i en redoxanalyse

Endnu en faldgrube fortjener sit eget afsnit, fordi den forstyrrer selve målingen snarere end dyret. Alamar Blue-analysen af energiforbrug bygger i sig selv på redoxkemi: resazurin reduceres til fluorescerende resorufin. Methylenblåt indgår også i redoxkemi. I cellefrie kontroller reducerede begge opdrætskoncentrationer Alamar Blue-fluorescensen lidt, men signifikant, efter 24 timer. I dyreforsøgene blev eksponerede embryoner skyllet mindst tre gange i farvestoffrit medium før analysen, og den biologiske effekt hos klækkede larver var større end den cellefrie interferens. Begge dele er derfor sande: skyllede dyr har en reel stofskifteeffekt, og farvestof, der ikke er skyllet væk, lægger en direkte kemisk artefakt oveni. Kontrollerne skal adskille de to, ellers er ingen af tallene meningsfulde. Generelle råd om fortolkning af farvestofbaserede analyseresultater er usædvanligt relevante her.

Tidslinje for udviklingsstadier

Det originale materiale til denne artikel. Koncentrationerne er de to standardværdier ved opdræt, 0.00005% og 0.0001%, medmindre andet er angivet.

Det mønster, man skal huske, er en tidlig stigning og et senere fald i stofskifteendepunkterne, med adfærdseffekter under eksponeringen, som ikke kunne påvises efter udskillelse i den ene test, hvor det blev undersøgt.

Tjekliste for design af kontroller

Det andet originale materiale. Brug det, når zebrafiskprotokoller med methylenblåt indgår i et forsøg.

1. Angiv farvestoffet som et reagens, ikke som vand. Oplys koncentrationen i både procent og micromolar, start og stop i timer eller dage efter befrugtning, planen for fornyelse og udvaskningsintervallet før hver måling.
2. Tilpas kontrollerne til spørgsmålet. Et studie af testkemikaliet kræver farvestoffrie kontroller; et studie af opdrætspraksis kræver forsøgsgrupper uden og med farvestof samt registrering af resultatet mod svamp, da ingen af de citerede studier målte effekten mod svamp.
3. Skyl før redoxanalyser, og kontrollér derefter. Skyl mindst tre gange i farvestoffrit medium, og kør sideløbende en cellefri kontrol med farvestof og reagens, fordi farvestoffet direkte reducerer Alamar Blue-signalet.
4. Betragt adfærd og monoaminendepunkter som højrisikoområder. Studier af bevægelsesaktivitet, forskrækkelsesreaktioner, angstlignende adfærd, antidepressiva og MAO-hæmmere bør undgå farvestoffet under målingen eller dokumentere neutralitet for det specifikke endepunkt; udvaskning i en til to dage fjernede én effekt på bevægelsesaktiviteten, men er ikke dokumenteret for andre forsøgsparadigmer.
5. Betragt stofskifte- og mitokondrieendepunkter som højrisikoområder på alle stadier. Iltforbrug, energiforbrug, membranpotentiale og transkripter for respirationskæden ændrer sig ved opdrætskoncentrationer, i modsatte retninger før og efter klækning.
6. Overfør ikke neutralitet mellem forsøgsdesign. Et nulresultat efter udvaskning dækker ikke igangværende eksponering; et nulresultat for morfologi dækker ikke stofskifte eller lægemiddelinteraktion; et resultat i én stamme, ved én temperatur eller med én testvarighed dækker ikke andre.
7. Angiv den retningslinje, du fulgte, og alternativet til den. Angiv udtrykkeligt koncentrationerne fra CCAC, de europæiske retningslinjer eller Cold Spring Harbor, og bemærk, hvor OECD's embryotest udelader farvestoffet, så læseren kan sætte forsøgsdyrenes betingelser i perspektiv.

Intet af dette taler imod at bruge farvestoffet til at holde æg i live. Det taler imod at lade et valg i opdrætspraksis følge uundersøgt med ind i dataene. Det blå i skålen er et molekyle med farmakologiske egenskaber, og de forsøg, der med størst sandsynlighed bliver påvirket, er netop de stofskifte- og neuroadfærdsscreeninger med høj kapacitet, som unge zebrafisk nu foretrækkes til. Registrér det, kontrollér for det, vask det ud før målingen, og kontrollér den analyse, som det måske ubemærket deltager i.