Reduktionstest med methylenblåt til vomvæske

En nyuddannet dyrlæge ringer fra en gård med et blåt prøverør i hånden. Hun tilsatte methylenblåt til vomvæske for ti minutter siden, og den blå farve er der stadig. Hun spørger, om hun skal give koen mere farvestof.

Spørgsmålet afslører en forkert forståelse af testen. I reduktionstesten med methylenblåt til vomvæske tilsættes farvestoffet til prøverøret, aldrig til dyret. Hele analysen foregår i røret. Tiden, det tager for den blå farve at forsvinde, fortæller noget om mikroberne i den pågældende prøve, ikke om en behandling, dyret har brug for.

Forvirringen er forståelig, fordi methylenblåt optræder i tre forskellige veterinære sammenhænge. Denne artikel holder dem adskilt og viser, hvordan reduktionstiden vurderes sammen med pH, protozoer, prøvetagningskvalitet og kliniske tegn.

Hvad testen faktisk måler

Methylenblåt er blåt i oxideret form og næsten farveløst i reduceret form. Frisk vomvæske fra et sundt dyr er stærkt reducerende, fordi anaerobe bakterier aktivt fermenterer foder. Når en lille mængde farvestof blandes i sådan en væske, fjerner bakteriernes stofskifte farven inden for få minutter.

Princippet er derfor enkelt: En aktiv anaerob flora fjerner den blå farve hurtigt, mens en inaktiv eller beskadiget flora fjerner den langsomt. En kort tid betyder større reduktionsevne i den pågældende prøve. En forlænget tid tyder på nedsat mikrobiel aktivitet, forudsat at prøven er indsamlet og håndteret korrekt.

Testen måler ikke vommens redoxpotentiale direkte. Et metodestudie på kvæg, som sammenlignede reduktionstesten med direkte millivoltmålinger, fandt ingen lineær sammenhæng mellem reduktionstiden og det målte redoxpotentiale. Studiet konkluderede, at de to ikke bør betragtes som indbyrdes udskiftelige målinger af samme variabel. Den fulde sammenligning er opsummeret på PubMed. Betragt reduktionstesten som en funktionstest af den mikrobielle population, ikke som en billig elektrode.

Merck/MSD's beskrivelse af simpel indigestion hos drøvtyggere placerer forlænget reduktionstid i samme mønster som unormal pH i vommen og et reduceret antal protozoer. Ingen enkeltværdi stiller diagnosen. Det gør det samlede mønster.

En standardprocedure ved dyret

Protokollerne varierer lidt mellem uddannelsesstederne, så registrer de præcise volumener og den temperatur, du bruger, og sammenlign kun resultater inden for den samme protokol. En almindeligt undervist version er:

Indsaml mindst 10 til 20 mL frisk vomvæske med minimal spytforurening, luftkontakt og afkøling. Udfør testen straks.
Tilbered 0.03 procent methylenblåt, hvilket svarer til 0.3 mg pr. mL.
Tilsæt farvestof svarende til 5 procent af væskens volumen. Det er 1.0 mL farvestof til 20 mL væske eller 0.5 mL farvestof til 10 mL væske. Begge giver samme forhold på 20 til 1 mellem væske og farvestof.
Behold et andet rør med ubehandlet væske fra samme prøve som farvekontrol.
Bland forsigtigt, start tidtagningen med det samme, og hold røret tæt på kropstemperatur, omkring 37 til 39 grader Celsius afhængigt af den lokale protokol.
Registrer tiden, indtil testrøret har samme farve som kontrollen. En tynd blå ring ved overfladen mod luften kan blive ved med at være der, fordi ilt reoxiderer farvestoffet på dette sted. Vent ikke på, at den ring forsvinder.

Methylenblåts redoxkemi forklarer, hvorfor ilt er vigtig her. Kraftig omrystning, et vidt åbent rør eller en lang forsinkelse lukker ilt ind og holder farvestoffet blåt længere, end forholdene i selve vommen ville gøre. Detaljerne i en teknik til indsamling af vomvæske uden forurening er vigtige af samme grund. Spyt fortynder prøven og hæver pH, så ved brug af mavesonde kasserer mange klinikere den første portion, når volumen tillader det.

Hvad de forskellige observationer måler

Reduktionstiden besvarer kun ét spørgsmål. Vurderingen af vommen nedenfor viser, hvad hver klinisk observation bidrager med. Brug hele rækken, ikke kun én celle.

Observation	Hvad den måler	Typisk klinisk fund	Almindelige fejlkilder
Reduktionstid for methylenblåt	Anaerobe bakteriers funktionelle reducerende aktivitet i prøven	Hos kvæg ofte 2 til 6 minutter; hos får og geder ofte hurtigere, med 6 minutter som praktisk grænse for tilstrækkelig aktivitet og tider over 10 minutter som markant unormale	Kold, forsinket, luftpåvirket eller spytfortyndet prøve; lavt substratniveau efter længerevarende anoreksi; orale antimikrobielle midler; sammenligning på tværs af forskellige farvestofforhold eller temperaturer
Vommens pH	Kemisk miljø, syre- eller alkalibelastning	Hos grovfoderfodret kvæg ofte omkring 6.0 til 7.2; tekster om små drøvtyggere angiver ofte omkring 6.5 til 7.5; foderration og tid siden fodring ændrer værdien	Spytforurening hæver pH i prøver udtaget med mavesonde; tab af kuldioxid efter indsamling; kornfodring sænker pH
Antal protozoer og deres motilitet	Ciliatpopulationens integritet, især store former, som er følsomme over for forstyrrelser	Mange organismer i forskellige størrelser med kraftig, retningsbestemt bevægelse i en varm, frisk dråbe	Afkøling sænker bevægelsen; svær acidose kan udrydde protozoer; forsinkelse får en normal prøve til at virke træg
Lugt, farve og konsistens	Fermenteringens karakter og forurening	Let aromatisk, grønbrun, let viskøs væske	Rådden eller sur lugt ved svær dysbiose; vandig væske eller væske med meget spyt efter dårlig prøvetagning
Vomkontraktioner og appetit	Dyrets samlede formavefunktion og foderindtag	Regelmæssige kontraktioner og vedvarende drøvtygning hos et vågent dyr	Nylig ændring af foderrationen, smerter, dehydrering, systemisk sygdom

Tabellen er det centrale. En forlænget reduktionstid sammen med træge protozoer, unormal pH og svage kontraktioner peger på en reel hæmning af den mikrobielle aktivitet. En isoleret forlænget tid hos et vågent, drøvtyggende dyr med livlige protozoer peger på prøven, ikke på vommen. Gentag prøvetagningen, før du handler.

Vurdering af tiden sammen med pH og sygehistorie

Foderrationen fastlægger udgangspunktet. Kraftfoderrige rationer fermenterer hurtigt og kan fjerne farvestoffet på omkring et minut, mens høbaserede rationer kan kræve flere minutter, selv hos sunde dyr. En kort tid beviser derfor ikke i sig selv bedre sundhed. Den viser, at mere fermenterbart substrat har mødt aktive mikrober.

Svær overbelastning med korn bryder denne enkle sammenhæng. Den tidlige kulhydratfermentering kan være intens, hvorefter syreskader hæmmer den normale flora og protozoerne, og reduktionstiden bliver forlænget. Derfor siger en undervisningsregel, at testen ikke er gyldig, når vommens pH er under omkring 5.5. På det tidspunkt har den flora, der testes, ændret sig.

En praktisk guide til mønstrene:

Normal pH med reduktion inden for omkring 6 minutter tyder på funktionelt aktiv flora.
Normal pH med markant forlænget reduktion tyder på inaktivitet som følge af anoreksi, antimikrobiel påvirkning eller en kompromitteret prøve.
Høj pH med forlænget reduktion ses ofte efter længerevarende anoreksi med lidt substrat, men overvej spytforurening fra sonden.
Lav pH med nedsat protozoaktivitet giver mistanke om kulhydratrelateret dysbiose. Vejledning i fortolkning af vommens pH er nyttig her. Værdier under 5.5 sammen med påvirket almentilstand peger væk fra simpel indigestion og mod overbelastning med korn og svær acidose.

Registrer altid nylig oral indgift af tetracykliner, ionoforer i foderet, længerevarende systemisk brug af antimikrobielle midler, pludselige ændringer i foderrationen, varigheden af anoreksi og vandindtag. MSD-manualen advarer specifikt om, at orale tetracykliner kan hæmme vommens mikroflora betydeligt. Ionoforer ændrer bevidst bakteriepopulationerne. Uden denne sygehistorie kan en forlænget tid ikke fortolkes.

Prøvetagningskvaliteten skal tillægges lige så stor vægt. Kontrollerede undersøgelser fandt højere pH og lavere indhold af flygtige fedtsyrer i prøver udtaget med mavesonde end i prøver udtaget via kanyle fra de samme dyr, hovedsageligt på grund af spyt. 60 minutter efter indsamlingen var reduktionstiden signifikant forlænget for alle testede volumener, og små prøver var mest påvirkede. Indsaml mindst 10 mL, test inden for 30 minutter, udfør reduktionstesten tidligt, hold prøven varm, og begræns luftkontakten.

Tre anvendelser, som ikke må forveksles

Samme farvestof, tre forskellige systemer.

For det første den analyse af vomvæske, der er beskrevet her. Prøvematerialet er indsamlet vomvæske. Farvestoffet tilsættes in vitro ved 0.03 procent. Slutpunktet er tiden til affarvning. Formålet er at vurdere mikrobiel reducerende aktivitet.

For det andet methylenblåt givet til en levende drøvtygger. Det etablerede eksempel er intravenøs behandling af nitrat- eller nitritforgiftning med methæmoglobinæmi, hvor lægemidlet genopretter funktionelt hæmoglobin. Regler om dosis, formulering, restkoncentrationer og tilbageholdelsestid gælder. Den beslutning har intet at gøre med at tage tid på et prøverør. Hvis farvestoffet bruges som sporstof in vivo ved en bestemt procedure, handler princippet om, hvor farvestoffet bevæger sig hen, ikke om hvor hurtigt vommens mikrober reducerer det.

For det tredje reduktionstesten for mælk. Prøvematerialet er mælk. Farvestoffet tilsættes til mælkeprøven. Hurtigt tab af den blå farve tyder generelt på større mikrobiel aktivitet og dårligere holdbarhed, mens langsom reduktion tyder på bedre kvalitet. Testen hører til fødevaremikrobiologi og test af mælkekvalitet, ikke vommedicin, og den er ikke en bakterietælling.

Tydelige betegnelser forebygger fejl: reduktionstid i vomvæske, systemisk behandling med methylenblåt eller brug som sporstof og reduktionstest for mælk. Sikkerhedsreglen kan siges i én sætning. Farvestof til analysen af vomvæske bliver i laboratorierøret, og røret kasseres. Det gives aldrig til dyret for at udføre testen.

En kort regel til opkaldet fra gården

Standardiser farvestoffet til 0.03 procent og 1 del farvestof til 20 dele væske, test frisk væske tæt på kropstemperatur mod en ubehandlet kontrol, og vurder minutterne sammen med pH, protozoernes motilitet, prøvetagningskvalitet, foderration, lægemidler, kontraktioner, appetit, fæces og hydreringsstatus. Et enkelt tal stiller aldrig diagnosen indigestion. Det gør et sammenhængende mønster.