Methylenblåt og inflammatorisk signalering: inflammasomer, IL-6 og STAT3

Forestil dig, at tre laboratorier rapporterer, at det samme blå stof er antiinflammatorisk. Ét viser mindre IL-1beta fra makrofager. Ét viser mindre iNOS-enzym i samme celletype. Ét viser mindre IL-6 i blodet og mindre STAT3-aktivitet i hjernen. Det er fristende at samle de tre resultater i én påstand. Men det skjuler, hvad der faktisk blev fundet.

Hvert resultat hører til en særskilt signaleringsmekanisme med sin egen udløsende faktor, sit eget samlingstrin og sin egen måleparameter. Methylenblåt påvirker hver mekanisme på et forskelligt sted. Om noget af dette forbedrer et helbredsudfald, er et særskilt spørgsmål, som behandles i vores oversigt over methylenblåt og inflammation. Denne side holder sig til signalvejene.

Signalvej 1: samling af inflammasomer og caspase-1

Et inflammasom er et proteinstillads, som opbygges efter behov inde i en myeloid celle. Delene er en sensor, et adaptorprotein kaldet ASC og et effektorenzym kaldet caspase-1. Når komplekset er samlet, spalter caspase-1 pro-IL-1beta og pro-IL-18 til deres udskilte former og kan udløse pyroptose, en inflammatorisk form for celledød. Sensoren bestemmer typen: NLRP3 reagerer på krystaller og poredannende toksiner såsom nigericin og ATP, NLRC4 reagerer på bakterielt flagellin, AIM2 reagerer på cytosolisk dobbeltstrenget DNA, og den ikke-kanoniske signalvej reagerer på intracellulært lipopolysakkarid.

Aktivering kræver to signaler. Det første signal er klargøring: en ligand til en Toll-lignende receptor driver NF-kB-afhængig transkription af NLRP3 og pro-IL-1beta, så delene er til stede. Det andet signal er samling: en anden udløsende faktor får ASC til at oligomerisere til aggregater, caspase-1 til at blive spaltet til sit p20-fragment og modent IL-1beta p17 til at blive frigivet. Mitokondrielle reaktive iltforbindelser og optagelse af krystaller er kendte bidragydere til det andet signal for NLRP3.

Makrofagstudiet fra 2017 om bred hæmning af inflammasomer testede methylenblåt ved begge signaler. I knoglemarvsmakrofager fra mus, der var klargjort med lipopolysakkarid, fremkaldte nigericin, ATP og mononatriumuratkrystaller hver især frigivelse af IL-1beta og caspase-1 samt dannelse af ASC-aggregater. Methylenblåt ved 20 til 200 micromolar reducerede alle tre på en dosisafhængig måde uden at dræbe cellerne. Flagellin og Salmonella for NLRC4, dobbeltstrenget DNA og Listeria for AIM2 samt transfekteret lipopolysakkarid eller levende E. coli for den ikke-kanoniske signalvej viste det samme mønster. Stoffet alene udløste ikke frigivelse, og kontrolplader viste ingen antibakteriel effekt, så resultatet vedrører værtsorganismens respons.

Tidligere i signalvejen blev tre påvirkninger målt. Rotenoninduceret mitokondrielt superoxid faldt med methylenblåt, og rotenondrevet frigivelse af IL-1beta faldt tilsvarende. Optagelsen af fluorescerende kugler faldt, hvilket stemmer overens med reduceret fagocytose før registreringen af krystaller. En reporter drevet af NLRP3-promotoren med to NF-kB-bindingssteder viste lavere aktivitet med methylenblåt, mens en afkortet promotor uden disse steder ikke reagerede. I et cellefrit reagensglas sænkede methylenblåt også direkte aktiviteten af rekombinant humant caspase-1. Tilsætning af stoffet alene under klargøring eller alene under aktivering reducerede stadig frigivelsen af IL-1beta, IL-18 og caspase-1, så begge trin er involveret.

Museforsøgene viste samme selektivitet. En dødelig dosis lipopolysakkarid dræbte kontroldyrene inden for få timer, mens methylenblåt forbedrede overlevelsen; IL-1beta i bughulen faldt, men IL-6 i den samme væske gjorde ikke. I en model for Listeria-peritonitis faldt IL-1beta i bughulen, mens det samlede celletal var uændret. Humane THP-1-monocytter reagerede ligesom musemakrofager på tværs af alle fire inflammasomtyper. Et inflammasomresultat forklarer modning af IL-1beta og IL-18, ikke alle cytokiner. Derfor besvarer formen på hjernens immunceller i forsøg med mikroglia og astrocytter også et andet spørgsmål end samlingen af proteinstilladset.

Signalvej 2: iNOS-transkription via binding af NF-kB og STAT1

Inducerbar nitrogenoxidsyntase, eller iNOS, er næsten ikke til stede i hvile og transskriberes efter behov. Lipopolysakkarid driver dette hovedsageligt gennem nedbrydning af IkB-alpha efterfulgt af fosforylering af NF-kB og transport ind i cellekernen. Interferon-gamma driver det hovedsageligt gennem Janus-kinasens fosforylering af STAT1 efterfulgt af transport af STAT1 ind i cellekernen. Hver faktor binder derefter til sit bindingssted på iNOS-promotoren. Enzymaktivitet og geninduktion er særskilte kontrolpunkter, og et lægemiddel kan virke på det ene eller begge.

Studiet fra 2015 om iNOS-induktion i makrofager og endotoksæmiske mus placerede effekten på mRNA-niveauet. I RAW 264.7-celler og primære musemakrofager reducerede 1 micromolar methylenblåt, givet 30 minutter før lipopolysakkarid, interferon-gamma eller begge, iNOS-protein og mRNA over 8 til 24 timer, med lavere nitrit i mediet og uden tab af levedygtighed. Hos mus, som fik 25 mg per kg lipopolysakkarid, reducerede en enkelt dosis på 5 mg per kg en time tidligere iNOS-protein og mRNA i lunger, lever og hjerte.

Den karakteristiske detalje er det, som ikke ændrede sig. Nedbrydning af IkB-alpha, fosforylering af NF-kB, fosforylering af STAT1 og ophobning af begge faktorer i cellekernen forblev upåvirket. Bruddet kom ét trin senere: kerneekstrakter viste mindre binding af NF-kB til dets DNA-element efter lipopolysakkarid og mindre binding af STAT1 efter interferon-gamma. Kromatinimmunpræcipitation bekræftede, at begge faktorer i mindre grad var bundet til iNOS-promotoren inde i cellerne. Tumornekrosefaktor alfa, hvis promotor også bruger NF-kB, faldt ligeledes. Faktorerne blev aktiveret og nåede frem, men bandt dårligt til deres mål-DNA.

Bemærk kontrasten til signalvej 1. Dette handler om faktorers binding til DNA, bruger STAT1 frem for STAT3 og måler mRNA, protein og nitrit frem for ASC-aggregater og caspase-1-fragmenter. Vores kort over methylenblåts mål på tværs af cellemodeller holder dette transkriptionsniveau adskilt fra direkte enzymmålinger og mitokondrielle målinger.

Signalvej 3: IL-6 i serum og aktivering af STAT3 i væv

IL-6 signalerer gennem gp130-receptorfamilien til kaskaden fra Janus-kinase til STAT3. Fosforyleret STAT3 dimeriserer, trænger ind i cellekernen og driver inflammatoriske programmer, mens IL-6 selv er et NF-kB-mål. De to danner derfor en feedbacksløjfe, som ofte kaldes IL-6 til STAT3-aksen. De sædvanlige måleparametre er IL-6 i serum tidligere i signalvejen, forholdet mellem fosforyleret og samlet STAT3 samt effektorenzymer såsom iNOS og COX2 senere i signalvejen.

Musestudiet fra 2023 om IL-6 og STAT3 efter lipopolysakkarid målte aksen på tværs af kroppens kompartmenter. C57BL/6-hanmus fik 1 mg per kg lipopolysakkarid dagligt i tre dage samt 5 eller 10 mg per kg methylenblåt 30 minutter efter hver dosis. På dag tre var IL-6 i serum lavere i begge methylenblåtgrupper end med lipopolysakkarid alene, mens de fleste andre cytokiner i panelet ikke ændrede sig med behandlingen. Forholdet mellem fosforyleret og samlet STAT3 var lavere i hjernebarken, hippocampus og ørets hud, med mindre Iba-1-farvning af mikroglia, lavere iNOS og COX2 samt delvist dæmpet vægttab.

Her er to forbehold vigtige. Lavere IL-6 i serum sammen med lavere STAT3-fosforylering i væv stemmer overens med påvirkning af aksen, men identificerer ikke det primære påvirkningspunkt. Mindre cytokin tidligere i signalvejen, mindre receptorsignalering eller ændret fosfataseaktivitet kan nemlig alle give det samme forhold. Og vægt over tre dage med akut påvirkning er en måleparameter for hele dyret, ikke en symptom- eller remissionsscore. Den tilfører kontekst ud over en blot-analyse uden at gøre et signaleringsresultat til en behandlingspåstand. Den særskilte kemi bag mitokondriernes redoxhåndtering foregår parallelt med denne cytokinmekanisme og bør ikke sammenblandes med den.

Sammenligning af signalveje: påvirkningspunkter og måleparametre

Tabellen udelukker tre ugyldige overførsler af resultater. Et resultat om ASC-aggregater beviser ikke et resultat om STAT3. Et resultat om STAT1 og iNOS-promotoren beviser ikke et resultat om STAT3, selvom begge proteiner tilhører STAT-familien. Et resultat om IL-6 i serum beviser ikke reduceret samling af inflammasomer: i forsøget i bughulen faldt IL-1beta, mens IL-6 ikke gjorde. Hver række kræver sin egen udløsende faktor og måleparameter. Derfor kræver læsning af celleforsøg, dyreforsøg og kliniske studier af methylenblåt, at hver påstand knyttes til det niveau, der faktisk er målt.

Intet af dette fastslår dosering, sikkerhed eller gavn hos mennesker. Lipopolysakkaridmodeller bruger kontrollerede udløsende faktorer til at teste en mekanisme; de er ikke kopier af kronisk sygdom. Dosering samtidig med den udløsende faktor tester desuden forebyggelse af en fremkaldt ændring snarere end tilbageførsel af etableret sygdom. Hold denne beskrivelse af mekanismer adskilt fra patientudfald, og vurder enhver helbredspåstand ud fra det patientstudie, der ligger bag den.