Methylenblåt i G6PD-laboratorietest: hvad farvestoffet faktisk gør

En studerende ser på to reagensglas efter inkubation. Det ene har fået den forventede farve. Det andet har ikke. Den studerende konkluderer, at den anden patient har mangel på glukose-6-fosfatdehydrogenase. Konklusionen kan være rigtig, men ræsonnementet springer over det princip, der får testen til at virke. Intet i reagensglasset måler enzymet direkte. Reagensglasset måler det, enzymet producerer, med methylenblåt som mellemled.

Når denne indirekte måling er forstået, virker proceduren, kontrollerne og den lange liste over fejlagtige resultater ikke længere vilkårlige.

Det korte svar

Methylenblåt er en redoxindikator ved G6PD-testning. Enzymet G6PD danner NADPH, og NADPH-afhængige systemer reducerer blåt methylenblåt til dets farveløse leukoform eller bruger det til at transportere elektroner. Normal enzymaktivitet giver effektiv reduktion. Nedsat aktivitet giver langsom eller ufuldstændig reduktion. Det er hele signalet.

To historiske metoder bruger det samme farvestof, men har forskellige slutpunkter. Hold dem adskilt, så forsvinder det meste af forvirringen.

To test, ét farvestof, forskellige slutpunkter

Den første er den direkte methylenblåt-reduktionstest, som blev beskrevet af Sass og kolleger og senere evalueret af Gibbs. Her er slutpunktet selve farvestoffet: oxideret, blåt methylenblåt reduceres mod farveløst leucomethylenblåt, og hastigheden af denne ændring afspejler kapaciteten til at danne NADPH. Den oprindelige artikel om screeningen er registreret på PubMed under Sass et al. (1966).

Den anden er Brewers methæmoglobin-reduktionstest. Natriumnitrit oxiderer først hæmoglobin til brunt methæmoglobin. Methylenblåt fungerer derefter som mediator for elektronoverførsel: reduceret methylenblåt overfører reducerende ækvivalenter til methæmoglobin og omdanner det tilbage til rødt hæmoglobin. Det synlige slutpunkt er derfor brunt kontra rødt, ikke blåt kontra farveløst. Den oprindelige metode blev offentliggjort i Bulletin of the World Health Organization (Brewer et al., 1960).

Det er kemisk upræcist at kalde Brewer-analysen en affarvningstest. Farvestoffet indgår i en cyklus; hæmoglobinet skifter farve. Diagrammet nedenfor viser begge reaktionsveje.

Den underliggende reaktion

G6PD katalyserer det første oxidative trin i pentosefosfatvejen:

Glucose-6-phosphate + NADP+ becomes 6-phosphogluconolactone + NADPH + H+

Modne røde blodlegemer er stærkt afhængige af denne reaktionsvej for at få NADPH, som gennemgået i Blood af Luzzatto og kolleger (2020). NADPH holder glutathion reduceret og beskytter cellen mod oxidativ skade. Methylenblåt indgår i dette kredsløb som elektronacceptor. Tilstrækkeligt G6PD giver tilstrækkeligt NADPH, som giver effektiv reduktion. Lavt G6PD bryder kæden ved dens første led.

Tænk på farvestoffet som en brændstofmåler, ikke som motoren. Det viser tilgængeligheden af NADPH. Alt andet, der ændrer denne tilgængelighed eller aflæsningen, kan flytte viseren, uden at genet har ændret sig.

Sådan foregår proceduren af Brewer-typen

Reagenssammensætningerne har varieret gennem årtierne, så en beskrivelse til undervisningsbrug må ikke forveksles med en klinisk protokol. Hvert laboratorium følger sin egen validerede standardprocedure. Med dette forbehold fungerer den klassiske opstilling med reagensglas som følger, i en udgave dokumenteret med tre reagensglas og 3 timers inkubation i denne offentliggjorte anvendelse af metoden:

1. Patientglas: fuldblod tilsat glukose, natriumnitrit og methylenblåt. Nitrit danner methæmoglobin, glukose understøtter de røde blodlegemers stofskifte, og farvestoffet sørger for den NADPH-afhængige elektrontransport.
2. Oxideret kontrol: blod tilsat nitrit og glukose, men uden methylenblåt. Den viser det brune methæmoglobin-slutpunkt, som er mønstret ved mangel.
3. Hæmoglobinkontrol: blod tilsat vand. Den viser det røde hæmoglobin-slutpunkt, som er det normale mønster.
4. Inkubér alle reagensglas ved omkring 37 C, typisk i 3 timer, med forsigtig blanding.
5. Fortynd en lille delprøve fra hvert reagensglas i destilleret vand for at lysere cellerne og gøre farvesammenligningen tydelig.
6. Sammenlign patientglasset med de to kontroller. En tilbagevenden mod rødt tyder på betydelig reduktionskapacitet. En vedvarende brunlig farve tyder på udtalt mangel.

En historisk sammensætning brugte omkring 1 mL blod med reagenser ved cirka 180 mM natriumnitrit, 280 mM dextrose og 0.4 mM methylenblåt. Betragt disse tal som et eksempel fra litteraturen, ikke som en universel specifikation.

Aflæsning af resultatet

En kvalitativ screening skelner bedst omkring 30 til 40 procent af normal aktivitet, som beskrevet i denne oversigtsartikel i Malaria Journal om mangler ved påvisning af G6PD-mangel. Et normalt screeningsresultat betyder derfor, at analysen ikke påviste svær mangel. Det bekræfter ikke fuldt normal aktivitet.

Hvorfor screening kan vildlede

Retikulocytose efter hæmolyse er den klassiske årsag til et falsk normalt resultat. Unge røde blodlegemer og retikulocytter indeholder mere G6PD end gamle celler. Under en akut hæmolytisk episode kan de ældste celler med den mest udtalte mangel allerede være ødelagt, så der er en ung cellepopulation tilbage, hvis aktivitet måles som normal. Den samme biologiske mekanisme kan vildlede kvantitative analyser, ikke kun farvestofbaserede screeninger.

Nylig transfusion maskerer mangel, fordi donorens røde blodlegemer bidrager med deres eget enzym til prøven. Mayo Clinic Laboratories nævner transfusion blandt årsagerne til upålidelige enzymresultater sammen med retikulocytose og interferens fra leukocytter.

Heterozygote kvinder er den vanskeligste gruppe at vurdere. Tilfældig inaktivering af X-kromosomet giver en blanding af normale røde blodlegemer og røde blodlegemer med mangel, og den samlede aktivitet kan ligge hvor som helst fra svært nedsat til tilsyneladende normal. Kvalitative screeninger overser ofte intermediære fænotyper. WHO's dokumentation om G6PD-testning behandler denne begrænsning i detaljer.

Prøvens alder, opbevaringstemperatur, subjektiv vurdering af det visuelle slutpunkt, hæmatokrit og reagensernes kvalitet føjer analytisk støj til disse biologiske effekter.

Screening er ikke diagnosticering

Et screeningsresultat, der tyder på mangel, er intermediært eller ikke stemmer overens med det kliniske billede, kræver en kvantitativ G6PD-enzymanalyse. WHO betragter temperaturkontrolleret kvantitativ spektrofotometri som referencemetoden. Ved denne analyse tilsættes glukose-6-fosfat og NADP+ til et hæmolysat af røde blodlegemer, og dannelsen af NADPH følges ved stigende absorbans ved 340 nm. Ændringshastigheden er proportional med enzymaktiviteten, som normalt normaliseres til hæmoglobin og angives i enheder pr. gram. Den aktuelle kliniske laboratoriepraksis er opsummeret i Mayo-testkatalogets beskrivelse af G6PD-aktivitet.

Fortolkningen bruger laboratoriets validerede referenceinterval, ofte angivet i forhold til den normale aktivitet i befolkningen, hvor mangel almindeligvis vurderes omkring grænsen på 30 procent og intermediær aktivitet over denne. WHO's målproduktprofiler for G6PD-test (2022) beskriver denne diagnostiske ramme. Hvis nylig hæmolyse eller transfusion gør fænotypebestemmelsen upålidelig, gentages testen, når populationen af røde blodlegemer igen er i ligevægt, og molekylær testning kan tilføje oplysninger uden at erstatte enzymmålingen.

En grænse, der er værd at fastholde

Methylenblåt er i disse analyser et ex vivo-laboratoriereagens. Det hører til en anden diskussion end sikkerheden ved at give methylenblåt til en patient, som behandles i vejledningen om kontraindikationer for methylenblåt. Biokemien forbinder de to, da lægemidlet også er afhængigt af NADPH-afhængig reduktion, men et farvestof i et reagensglas er ikke en dosis i blodbanen. For mere baggrund om, hvordan farvestoffet fungerer som farvemiddel i en anden sammenhæng, se principper for farvning med methylenblåt, og for den kemiske familie, det tilhører, redoxfarvestoffer i laboratoriet.

Screening undersøger, om reduktionskapaciteten ser intakt ud. Bekræftende test undersøger, hvor meget enzym der faktisk er til stede. Farvestoffet besvarer det første spørgsmål godt, så længe ingen beder det om at besvare det andet.