Methylenblåt til DNA- og RNA-farvning: anvendelse i geler og på membraner

En studerende kører en agarosegel, farver den med methylenblåt og ser ingenting dér, hvor der var forventet et tydeligt bånd. Ved den næste arbejdsstation farver en postdoc en Northern-membran med den samme blå flaske og får skarpe ribosomale bånd på tre minutter. Den studerende konkluderer, at gelen mislykkedes. Det gjorde den ikke. De to opgaver var forskellige, og det samme farvestof løser dem med forskellig følsomhed, forskellig baggrund og forskellige regler for de efterfølgende trin.

DNA-farvning med methylenblåt og RNA-farvning med methylenblåt bygger på samme kemi, men har forskellige formål. I en gel viser farvestoffet, hvor meget nukleinsyre der befinder sig i en porøs matrix. På en membran viser det, om overførslen lykkedes, og om der blev påført ens mængder i banerne. Når den forskel er klar, giver protokollerne, detektionsgrænserne og kompatibilitetsgrænserne mening.

Det korte svar

Methylenblåt er et plant, kationisk farvestof, der binder til nukleinsyrer ikke-kovalent og reversibelt gennem en kombination af elektrostatisk tiltrækning til fosfat, interkalation mellem basepar og association med den lille fure. Det er netop reversibiliteten, der er pointen. Bånd kan farves og dokumenteres i synligt lys og derefter affarves eller oprenses til kloning, hybridisering eller genhybridisering med en probe.

Til farvning af dobbeltstrenget DNA i agarosegeler med methylenblåt er den hurtige standardopskrift 0.02 procent w/v (200 mikrogram pr. mL) i vand, omkring 15 minutters farvning efterfulgt af omkring 15 minutters affarvning i vand og visning på en lyskasse med hvidt lys. Til membraner er den klassiske Northern blot-opskrift 0.02 til 0.04 procent farvestof i natriumacetat omkring pH 5.2, flere minutters farvning efter overførsel og immobilisering, efterfulgt af skylning med vand og fuldstændig affarvning før hybridisering. Følsomheden er beskeden: fra titals til hundredvis af nanogram pr. gelbånd under gode forhold, mens forsigtige vejledninger angiver 0.5 til 1 mikrogram. Det er flere størrelsesordener over ethidiumbromid og SYBR-farvestoffer. På membraner findes der ingen brugbar enkelt detektionsgrænse for et transkript, fordi farvningen hovedsageligt viser ribosomalt RNA i store mængder og det samlede påførte materiale. Brug ikke en kosttilskudsopløsning fra detailhandlen som erstatning i nogen af opskrifterne. Validerede metoder forudsætter farvestof af analysekvalitet, definerede buffere og RNase-fri håndtering, når RNA indgår.

Sådan virker bindingen, og hvor den kan vildlede

Den nyttige model har tre dele. For det første tiltrækkes det positivt ladede ringsystem af den negativt ladede fosfatrygrad. Spektroskopiske undersøgelser viser, at denne elektrostatiske komponent dominerer ved lavt saltindhold, mens modellering og molekylær dynamik viser interkalation og binding i den lille fure som stabile bindingsformer for dobbeltstrenget DNA, som opsummeret i en spektroskopisk undersøgelse af methylenblåts binding til DNA. For det andet findes der en vis GC-præference: modeller favoriserer CpG- og GpC-trin, og forsøg rapporterer en foretrukken association med GC-rige duplekser i arbejdet om methylenblåts interkalationspræferencer, men AT-duplekser binder også farvestoffet. Rutinemæssig farvning er ikke sekvensspecifik. For det tredje binder enkeltstrenget DNA og RNA hovedsageligt gennem elektrostatik og stabling med tilgængelige baser og dupleksområder, hvilket forklarer, hvorfor farvningsstyrken varierer med længde, sekvens og sekundærstruktur.

Det har to konsekvenser. Fordi bindingen er ikke-kovalent, vaskes farvestoffet ud. Bånd i polyakrylamid falmer hurtigt, medmindre de fikseres specifikt, og der findes en særlig variant med permanent fiksering, netop fordi normal farvning er midlertidig, som beskrevet af Soto og Draper for PAGE-geler. Fordi farvestoffet er en fotosensibilisator, kan langvarig, kraftig belysning af farvet DNA i nærvær af ilt oxidere guanin og med tiden skabe enkeltstrengsbrud, en mekanisme beskrevet i arbejdet om guanинoxidation sensibiliseret af methylenblåt. Kortvarig visning i hvidt lys undgår den velkendte UV-skade fra klassiske arbejdsgange med ethidiumbromid, og det er en reel fordel ved præparativ isolering. Synligt lys er mere skånsomt, men ikke uskadeligt. Hold belysningen kort, når DNA'et skal klones. Se de to reaktionsveje i methylenblåts fotokemi for den bredere fotokemiske baggrund for denne forsigtighed. Se kemien bag methylenblåts struktur og egenskaber for redoxparret og ladningstilstandene, der forklarer, hvorfor den oxiderede form binder, og den reducerede form ikke gør.

Opgave et: farvning i geler

Gelfarvning besvarer ét spørgsmål: Er der nok nukleinsyre i dette bånd til, at det kan ses med det blotte øje? Dobbeltstrenget DNA i agarose er det bedst undersøgte tilfælde. Den oprindelige gelmetode med methylenblåt fra Flores og kolleger validerede den hurtige protokol med 0.02 procent på 1 procent agarose og viste vellykket isolering og kloning bagefter. Den samme leverandørprotokol findes på IBI Scientifics produktside for methylenblåt, hvor membranopskriften med 0.04 procent og den hurtige gelvariant står side om side.

Praktisk arbejdsgang:

1. Kør gelen som normalt. Farv efter elektroforesen, ikke under den, medmindre overførsel eller opløsningsevne er valideret for en modificeret metode.
2. Nedsænk gelen i 0.02 procent w/v methylenblåt i destilleret vand under forsigtig bevægelse i omkring 15 minutter.
3. Affarv med flere vandskift i omkring 15 minutter i alt, indtil matrixens baggrundsfarvning aftager, og båndene fremstår tydeligt.
4. Fotografér straks på en lyskasse med hvidt lys.

Agarose og polyakrylamid opfører sig forskelligt. Agarose tilbageholder farvestof i matrixen, så affarvningen er det langsomme trin. Tynde polyakrylamidgeler farves hurtigt, men mister også hurtigt farvestoffet, hvilket hjælper ved præparativ udskæring og gør arkivdokumentation vanskeligere. Syntetiske oligonukleotider i polyakrylamid kan lokaliseres med den samme opskrift med 0.02 procent på 20 til 30 minutter med gentagne vandvaske efter etablerede PAGE-metoder af Current Protocols-typen. Meget fortyndede varianter omkring 0.0002 procent i fortyndet TBE er beskrevet til præparativ isolering af oligonukleotider over flere timer, men dokumentationsgrundlaget er svagere.

Forskellen mellem DNA og RNA er vigtig. Dobbeltstrenget DNA giver den stærkeste strukturerede binding. RNA og enkeltstrenget DNA farves, men svagere og mindre forudsigeligt. Ved formaldehyd-agarosegeler med RNA springer de fleste laboratorier farvning med methylenblåt i gelen over og overfører først RNA'et til en membran, hvor det så farves. Dermed erstattes et svagt gelsignal med et skarpere membransignal og dokumentation af den påførte mængde.

Opgave to: farvning på membraner

Membranfarvning besvarer et andet spørgsmål: Lykkedes overførslen, og er banerne sammenlignelige? Den klassiske anvendelse er Herrin og Schmidts reversible Northern blot-farvning, oprindeligt med 0.04 procent farvestof i 50 mM natriumacetat ved pH 5.0 i 2 til 3 minutter efterfulgt af skylning med vand. Farvestoffet kan fjernes med fortyndet SDS i SSPE før hybridisering.

Den udbredte moderne variant udføres sådan:

1. Overfør RNA eller denatureret DNA til nylon eller nitrocellulose, og immobilisér det derefter ved UV-krydsbinding eller opvarmning, så prøven ikke går tabt under farvningen.
2. Valgfrit, men almindeligt: Fugt membranen i 5 procent eddikesyre i omkring 15 minutter.
3. Farv i 5 til 10 minutter i 0.02 til 0.04 procent methylenblåt i 0.3 til 0.5 M natriumacetat omkring pH 5.2.
4. Skyl og affarv i vand i 5 til 15 minutter, dokumentér, og fjern derefter resterende farvestof før hybridisering.

Positivt ladet nylon er mest udbredt til Northern blot. Nitrocellulose fungerer også med den samme arbejdsgang med eddikesyre og acetat. Billedet bruges til at bekræfte overførsel, sammenligne 28S- og 18S-bånd (eller 23S og 16S for bakterielt RNA), markere størrelsesmarkører og standarder og bevare en grov dokumentation til normalisering efter total-RNA. Publicerede Northern-metoder kvantificerer farvede ribosomale bånd for at kontrollere de påførte mængder, herunder mejerividenskabeligt arbejde, hvor ribosomale bånd farvet med methylenblåt blev brugt til normalisering. Southern-membraner kan visualiseres på samme måde, men farvestoffet er langt mere veletableret som kontrol af påført mængde og overførsel ved Northern blot. Desuden denatureres Southern-DNA før overførsel, så gelernes følsomhedstal kan ikke overføres direkte.

Detektionsgrænser og baggrund: hvor methylenblåt kommer til kort

Sammenligningen nedenfor er bevidst omtrentlig. Farvningens ydeevne afhænger af gelprocent, båndbredde, optik og omhyggelig affarvning. Betragt hvert tal som en størrelsesorden, ikke en specifikation.

Baggrundskontrol afgør, om det beskedne signal er brugbart. Frit farvestof er stærkt farvet, så kontrasten opnås ved at fjerne ubundet farvestof uden at fjerne det bundne. Mere koncentreret farvestof øger sjældent følsomheden. Det øger hovedsageligt affarvningstiden. Kør en fortyndingsserie med præcis den gel, membran og det kamera, der anvendes, og brug kun det interval, hvor den integrerede densitet forbliver proportional med den påførte mængde. Methylenblåt kan bruges til semikvantitativ normalisering af påførte mængder. Det er ikke en kvantitativ analyse med et stort dynamisk område, fordi membrankapacitet, overførselseffektivitet, mætning og affarvning varierer fra bane til bane.

Kompatibilitetsgrænser: hvad tåler farvningen?

Kloning efter farvning med methylenblåt er dokumenteret. Flores og kolleger skar farvede agarosebånd ud, isolerede DNA'et og udførte ligering og transformation med det. De rapporterede bedre kloning end efter ethidiumbromid med UV. Den sandsynlige årsag er mindre fotoskade, ikke en fordel ved selve farvestoffet. Hold eksponeringen for hvidt lys kort, og oprens det isolerede DNA med en normal gelekstraktionsmetode.

Dokumentationen for PCR og sekventering er mere begrænset. Resterende farvestof binder til nukleinsyrer, så affarv og oprens før enzymatiske trin. Korrekt oprenset DNA fra en gel farvet med methylenblåt forventes at fungere, men tolerancen for direkte overførte farvestofrester er ikke godt kvantificeret på tværs af polymeraser og sekventeringskemier. Tag den ikke for givet.

Blothybridisering er kompatibel, når rækkefølgen overholdes nøje: overfør, immobilisér, farv, dokumentér, affarv, hybridisér. Det er Herrin og Schmidts fremgangsmåde. Farvning før overførsel eller udeladelse af affarvning er en anden metode og kræver sin egen validering. Når farvestoffet er fjernet, kan standardfjernelse af prober og genhybridisering udføres som normalt. Se atlasset over mikroskopisk farvning for farvning på celleniveau med den samme farvestoffamilie og en forklaring på, hvorfor principperne for fikserede udstrygninger ikke kan overføres til metoder med levende celler.

Udskæring af bånd fungerer til præparativ agarose og til PAGE-oligonukleotider lokaliseret med methylenblåt, forudsat at varianten med permanent fiksering undgås. Elektroeluering efter affarvning er kemisk plausibel for et reversibelt bindende farvestof, men kontrollerede udbyttedata specifikt for methylenblåt er sparsomme. Afsalt eller fæld efter eluering.

Tilbagevendende problemer

Svage gelbånd betyder som regel, at massen er for lille til en kolorimetrisk farvning, især ved korte enkeltstrengede målsekvenser eller RNA. Påfør mere materiale, brug frisk farveopløsning, forlæng farvningen før koncentrationen øges, og afslut affarvningen tidligere. En ensartet blå gel uden kontrast betyder som regel overfarvning eller for få vandskift. Falmende PAGE-bånd er forventet kemi, ikke mislykket farvning. Fotografér hurtigt. Ujævn membranbaggrund peger på folder, bobler, fingeraftryk, ujævn bevægelse eller uensartet overførsel. Fortolk ikke dette som ulige påførte mængder uden en hybridiseringskontrol. Et udtværet, svagt ribosomalt mønster kan betyde nedbrydning, men også ufuldstændig overførsel, for lidt total-RNA (typiske baner indeholder fra flere til tocifrede antal mikrogram) eller overdreven affarvning. Farvestoffet viser ribosomalt RNA, som findes i store mængder. Det viser ikke et bestemt transkript. Den opgave tilhører proben.

Sikkerhed og håndtering uden overdrevne påstande

Methylenblåt er enklere at håndtere end ethidiumbromid, men det er ikke harmløst. Et aktuelt sikkerhedsdatablad fra MilliporeSigma klassificerer farvestoffet som akut oralt toksisk i kategori 4, farligt ved indtagelse, og angiver bortskaffelse gennem en godkendt affaldsordning i Sigma-Aldrichs sikkerhedsdatablad for methylenblåt. Ethidiumbromid har stærkere advarsler om genotoksicitet, herunder mistanke om påvirkning af kønsceller i Sigma-Aldrichs sikkerhedsdatablad for ethidiumbromid, og geler og opløsninger med stoffet holdes almindeligvis adskilt som farligt kemisk affald, som bemærket i Thermo Fishers vejledning om nukleinsyrefarvestoffer. Følg sikkerhedsdatabladet og institutionens regler for begge stoffer. Opbevar tørt farvestof tørt og tæt lukket, genbrug kun arbejdsopløsningen som tilladt i protokollen, opbevar farvede membraner tørt mellem filterark, og fotografér geler, før båndene diffunderer væk.

Husk tommelfingerreglen ved laboratoriebordet. Geler tester synlighed ved store prøvemængder i hvidt lys. Membraner tester overførsel og påførte mængder, før proben udfører det følsomme arbejde. Ét farvestof bruges til begge opgaver, med beskeden følsomhed, reversibel binding og en fast rækkefølge af trin.