Methylenblåt og ALS: hvorfor resultaterne varierer mellem forsøgsmodeller

Søger du efter methylenblåt og ALS, finder du to påstande, der ser ud til at modsige hinanden. Den ene siger, at det blå farvestof beskyttede neuroner i ALS-modeller. Den anden siger, at det ikke havde nogen virkning i en ALS-musemodel. Begge påstande henviser til reelle forskningsartikler, og begge artikler er værd at tage alvorligt. Modsætningen forsvinder, når man formulerer princippet bag hvert forsøg: Modellen er påstanden.

Et resultat hos en orm er en påstand om en orm. Et resultat hos en fiskelarve er en påstand om en fiskelarve. Ingen af delene er en påstand om en patient, før et sygdomsforløb hos et pattedyr underbygger det. Denne artikel sammenligner de to hyppigst citerede forskningsartikler side om side, så du kan se, hvorfor deres svar er forskellige.

De to forsøg i én tabel

Hold denne tabel åben, mens du læser. Den rummer alle væsentlige forskelle mellem studierne.

Genetikken er forskellig, arterne er forskellige, administrationsvejen er forskellig, tidspunktet er forskelligt, og endepunkterne er forskellige. Genotypen er kun én af fem forskelle, så de to studier kan ikke bevise, at methylenblåt virker selektivt på én ALS-relateret mekanisme. De viser noget mere afgrænset, men stadig nyttigt: En markant genopretning ved tidlig, direkte eksponering i simple modeller blev ikke overført til et sygdomsforløb hos pattedyr med kronisk oral behandling.

Det positive resultat: hvad studiet med orme og fisk viste

I studiet med orme og fisk fra 2012 blev muteret humant TDP-43 eller FUS udtrykt i ormenes motorneuroner, og muteret humant mRNA blev injiceret i fiskeembryoner. Det er modeller for proteotoksicitet. De genskaber det muterede proteins toksiske virkninger på bevægelse og neuronernes form over dage, ikke hele forløbet af ALS hos voksne mennesker over år.

Behandlingen begyndte meget tidligt. Ormene voksede på agar med methylenblåt fra klækningen. Fiskeembryonerne lå i en lægemiddelopløsning natten over fra 24 timer efter befrugtningen, og deres adfærd blev testet omkring to dage senere. Der var ikke en blod-hjerne-barriere mellem lægemidlet og neuronerne på samme måde som hos et pattedyr, og lægemiddelkoncentrationen i plasma eller hjerne blev ikke målt.

Under disse betingelser var virkningerne store og ensartede. Både 6 og 60 μM reducerede aldersafhængig lammelse hos TDP-43- og FUS-orme. På dag 12 i voksenstadiet var omtrent 80 procent af de ubehandlede TDP-43-orme lammede mod omkring 10 procent af de orme, der var blevet behandlet fra klækningen. En synaptisk test pegede i samme retning: TDP-43-orme var overfølsomme over for aldicarb, et lægemiddel, der bruges til at undersøge neuromuskulær transmission, og methylenblåt flyttede responsen tilbage mod det normale. Antallet af degenererende motorneuronudløbere faldt, med den tydeligste virkning ved 60 μM. Hos fisk blev svømning udløst af berøring væsentligt forbedret, og forkortede motoriske aksoner voksede tilbage mod normal længde ved 30 eller 60 μM, selv om genopretningen var delvis snarere end fuldstændig.

Dataene om oxidativt stress er forenelige med en antioxidantfortolkning. Muterede orme og fisk viste forhøjede mål for reaktive iltforbindelser, som faldt med behandlingen, og normale orme, der fik methylenblåt, overlevede en prooxidativ belastning langt længere end ubehandlede orme. Men to begrænsninger er vigtige. De samlede niveauer af muteret TDP-43- og FUS-protein faldt ikke, og studiet kvantificerede ikke proteinaggregater direkte. Det viser derfor funktionel genopretning uden at bevise fjernelse af aggregater. Enhver, der følger, hvordan redox- og mitokondriehypoteser normalt formuleres, bør betragte mekanismen som understøttet, men ikke afklaret.

Tidspunktet var den mest lærerige detalje. Da forfatterne ventede til dag 5 i voksenstadiet med at begynde behandlingen, var andelen med lammelse på dag 12 omkring 55 procent i stedet for omkring 10 procent ved behandling fra klækningen. Samme lægemiddel, samme orm, samme mutation, langt mindre virkning. Tidlig forebyggende eksponering stod for en stor del af den tilsyneladende fordel.

Nulresultatet: hvad SOD1-musestudiet viste

Musestudiet fra 2011 stillede et vanskeligere spørgsmål i et strengere system. Kongene SOD1 G93A-mus udvikler sig fra rystelser i bagbenene gennem gangbesvær og tab af evnen til at vende sig tilbage til normal stilling til et foruddefineret terminalt endepunkt. Behandlingen begyndte før symptomerne på dag 45 og fortsatte dagligt, mens observatører vurderede neurologiske tegn på en skala fra 0 til 6. Det er et forsøg, der omfatter hele sygdomsforløbet, hvilket gør det tættere på det, en patient ville lægge vægt på, end nogen lammelseskurve hos en orm.

De vigtigste resultater var nulresultater. Den samlede symptomdebut indtraf efter 121 dage hos kontrolgruppen mod 124 dage med methylenblåt, en forskel, der ikke var signifikant. Overlevelsen til slutstadiet var 167 dage mod 170 dage, heller ikke signifikant. Enkelte sekundære delanalyser faldt ud til behandlingens fordel: Hunnerne viste omkring 7 dages forsinkelse af symptomdebuten, og behandlede dyr tilbragte lidt mere tid i mildere stadier og mindre tid i svære stadier. Med små kønsopdelte undergrupper og mange sammenligninger af stadier bør disse delanalyser læses som hypotesegenererende snarere end som bevis. Der blev hverken foretaget neurontællinger, en test for SOD1-aggregering eller målinger af oxidative eller inflammatoriske markører. Studiet kan derfor heller ikke sige, om lægemidlet nåede sine mål og ikke virkede, eller blot aldrig påvirkede dem ved denne dosis. Kun én dosis blev testet.

Forfatterne fremhævede selv den mest grundlæggende begrænsning, som gælder i begge retninger. SOD1 G93A med højt kopital modellerer sygdom forårsaget af toksisk SOD1 godt, men SOD1-sygdom udgør en lille del af familiær ALS og har en anden biologi end de fleste sporadiske tilfælde. De foreslog at teste kandidater igen i TDP-43-baserede pattedyrmodeller. Dette forslag er siden blevet mere kompliceret, fordi forfatterne til studiet med orme og fisk bemærker, at et separat TDP-43-musestudie med methylenblåt heller ikke forbedrede motoriske endepunkter. Et stof kan derfor se lovende ud i ét TDP-43-system og være uden virkning i et andet TDP-43-system. Systemet betyder lige så meget som genet.

Hvorfor forbedring hos en orm eller fisk ikke kan dokumentere en fordel hos patienter

Tænk på hver model som et svar på et forskelligt spørgsmål.

For det første er biologien forskellig. TDP-43 og FUS er nukleinsyrebindende proteiner med fælles genetiske interaktioner i disse simple systemer, mens SOD1-toksicitet forløber gennem delvist forskellige indledende mekanismer. Et lægemiddel, der afhjælper én form for proteotoksisk stress, behøver ikke at afhjælpe en anden, og succes mod embryonal overekspression behøver ikke at forudsige succes mod langsom neurodegeneration hos voksne med inflammation, involvering af gliaceller og systemisk svækkelse.

For det andet er eksponeringen forskellig. Kontinuerlig badeeksponering ved mikromolære koncentrationer er ikke det samme som oral dosering. Optagelse i tarmen, førstepassagemetabolisme, binding til plasmaproteiner, indtrængen i hjernen og clearance ligger alle mellem en indtaget dosis og et motorneuron i rygmarven. Ingen af studierne målte lægemiddelniveauer i nervesystemet, så ingen af dem kan sætte sin koncentration i relation til den anden.

For det tredje er tidspunktet forskelligt. Fordelene hos orme og fisk afhang i høj grad af behandling, før de patologiske forandringer ophobedes. Behandlingen af musene begyndte også før symptomerne, hvilket er en styrke, men behandling af mennesker ville næsten altid begynde efter symptomdebuten, altså endnu senere. Et forebyggende signal i en todages embryotest er et udgangspunkt for forskning, ikke en model for klinisk brug.

For det fjerde er endepunkterne forskellige. Lammelse efter 12 dage, aldicarbfølsomhed, aksonlængde i mikrometer og svømmedistance er proksimale fænotyper. Symptomdebut og overlevelse hos et pattedyr afspejler alle kroppens kompenserende og komplicerende processer. Lægemidler ændrer ofte proksimale mål uden at ændre overlevelsen, og det er derfor, man bruger endepunkter baseret på tid til en hændelse hos pattedyr.

Læsere, der ønsker en tjekliste til den næste overskrift, kan hente en fra sådan læser du prækliniske studier: Spørg om arten, transgenet, dosis og administrationsvej, om lægemiddelniveauer blev målt, hvornår behandlingen begyndte i forhold til de patologiske forandringer, om endepunktet var en kortvarig fænotype eller et sygdomsforløb, og om virkningen blev gentaget i et andet laboratorium. Det bredere evidensgrundlag for methylenblåt hos mennesker er fortsat det sted, hvor man bør undersøge, om nogen af disse tidlige signaler udviklede sig til kliniske data.

Hvad det betyder for patienter og familier

Disse forskningsartikler giver ikke grundlag for en etableret behandlingsprotokol med methylenblåt mod ALS. Det positive studie understøtter yderligere forskning i oxidative og synaptiske mekanismer i TDP-43- og FUS-biologi. Nulresultatet taler imod at forvente en ændring af sygdomsforløbet ved kronisk oral dosering med denne eksponering i sygdom af SOD1-typen. Tilsammen beskriver de uoverensstemmelse mellem modeller, ikke en behandlingsanbefaling.

Sikkerhed fortjener samme nøgterne behandling som effekt. ALS-studier hos mus siger intet om sikker dosering hos mennesker, og methylenblåt indebærer reelle risici for hæmolyse ved G6PD-mangel og serotonintoksicitet ved kombination med serotonerge lægemidler. Mistanke om G6PD-mangel, aktuel brug af antidepressiva og enhver planlagt ændring i medicin bør drøftes med en kliniker. Det samme gælder en gennemgang af generelle sikkerhedsdata for methylenblåt, før nogen handler på baggrund af overskrifter om laboratoriefund.

Konklusionen kan sammenfattes i én sætning. Methylenblåt gav en markant genopretning af fænotyper ved tidlig eksponering i TDP-43- og FUS-modeller hos orme og fiskelarver, men stort set ingen fordel for symptomdebut eller overlevelse i et SOD1-musestudie med kronisk oral behandling, så den redelige fortolkning er modelafhængig evidens, der ikke understøtter brug hos patienter.