Hvem udviklede den lilla blodfarvning? Methylenblåt, Malachowski, Romanowsky og Giemsa

Eosin er rødt. Methylenblåt er blåt. Bland de to, påfør blandingen på et tørret blodudstryg, og dele af udstryget bliver lilla.

Ikke alle dele. I et godt præparat bliver de hvide blodlegemers kerner rødlilla, og inde i en malariaparasit får kromatinet samme farve, mens de omgivende røde blodlegemer forbliver lyserøde, og cytoplasmaet forbliver gråblåt. Det er den lilla farve, der gør det muligt at skelne celletyperne fra hinanden.

Ingen af flaskerne indeholder lilla. Farven opstår kun, når et bestemt nedbrydningsprodukt af methylenblåt møder eosin på objektglasset, og i 1880'erne og 1890'erne vidste ingen, at dette produkt fandtes, endsige hvad det var. De mennesker, der jagtede farven, arbejdede alene med urene farvestoffer og uden nogen pålidelig måde at finde ud af, hvad der var i en flaske, efter at den havde stået på en hylde i to måneder.

Derfor har spørgsmålet i titlen mere end ét forsvarligt svar, og derfor ændrede svaret sig i 2011.

Et synligt resultat, der ændrede sig med blandingen

Farvningen blev ikke opfundet. Den blev til gennem en række bidrag. Hver ændring af blandingen gav præcis én ny synlig oplysning, og rækkefølgen af disse oplysninger er den tydeligste måde at forstå historien på.

Mønstret i den sidste kolonne er det vigtige. Hvert fremskridt udvidede farvespektret, og hver udvidelse gjorde endnu en struktur synlig. Den lilla farve er ikke pynt på teknikken; den er forskellen mellem at se, at en parasit er til stede, og at se, hvad den består af. Hvordan selve farvestoffet bevægede sig fra en BASF-farvestoffabrik ind i medicinen, er en længere historie med sine egne dokumenter. Hele forløbet ovenfor, med kilden bag hvert punkt, findes som en tidslinje over bidragyderne med kildelinks.

Figur: de samme seks blandinger tegnet som det, der var i skålen, og det, der kom ud af den. Cirklerne viser farvestofferne; felterne nedenunder viser de farver, som disse farvestoffer kunne frembringe i et blodudstryg. Intet før 1890 viser et rødlilla felt, og intet efter udelader det.

Manden, der brugte boraks med vilje

Ernst Malachowski var læge i Breslau, det nuværende Wrocław. Han tilbragte sit arbejdsliv i privat praksis og i en lille klinik, som han drev sammen med en kollega, og udførte laboratoriearbejde i sin fritid. Han blev født i Strzelno den 12. marts 1857, studerede medicin ved universitetet i Breslau og arbejdede fra 1882 til 1887 som assistent i intern medicin på Allehelgenshospitalet, dengang Tysklands næststørste hospital.

Han begyndte i 1888 med Chęcińskis og Plehns dobbeltfarvning. I et præparat fremstillet i 1889 så han, at kromatinet i plasmodiets kerne blev farvet anderledes end cytoplasmaet, men opdagede derefter, at han ikke kunne gentage resultatet. Han prøvede at gøre methylenblåt surt, hvilket gjorde det værre. Han prøvede at gøre det alkalisk med boraks, hvilket virkede hver gang. Han demonstrerede metoden offentligt den 15. juni 1890 og offentliggjorde en mere udførlig beskrivelse i august 1891, herunder anvisningen om boraks. Han bemærkede, at farvningen tog fireogtyve timer, og at resultaterne var lette at reproducere.

Fireogtyve timer er lang tid i et diagnostisk laboratorium, og hans artikel dvælede ikke ved parasitkernens purpurrøde farve. Uanset årsagen tog ingen den bevidste alkalinisering af methylenblåt op, før Nocht gjorde det igen i 1898. Malachowski skrev aldrig mere om blodfarvning.

Grunden til, at man indtil for nylig vidste så lidt om ham, ligger i arkiverne snarere end i noget mysterium. Næsten ingen spor af hans liv overlevede i den medicinske litteratur, og det, der overlevede, kom ad én vej. Hans datter Marie forlod Tyskland og rejste til London i 1939, gjorde tjeneste i den britiske hær og bosatte sig i Canada, og hendes samling af familiepapirer endte på Leo Baeck Institute i New York. Hendes bror Leo blev dræbt i Første Verdenskrig. Hendes søster Eva blev deporteret fra Breslau til transitlejren Izbica i april 1942 og kom aldrig tilbage. Hendes mor Hedwig tog sit eget liv den 22. april 1942 frem for at vente på den samme deportation. Malachowski var død i 1934, før alt dette skete.

En familiehistorie, der ender sådan, er en familiehistorie, der holder op med at blive citeret. De to artikler, der igen gav Malachowski en plads i farvningens udviklingshistorie, begge udgivet i 2011, blev udarbejdet på grundlag af arkivdokumenter i Poznań og Wrocław og Maries papirer i New York.

En muggen flaske og en heldig russer

Dmitri Romanowsky studerede medicin ved Det Militærmedicinske Akademi i Sankt Petersborg og arbejdede med malaria det meste af sit arbejdsliv. I 1890 offentliggjorde han en metode, der på papiret var næsten identisk med Chęcińskis: uændret methylenblåt og eosin, med lidt mere eosin.

I september 1891 offentliggjorde han den metode, der gjorde ham berømt, og den afgørende detalje var gemt i anvisningerne. Hans bedste resultater kom fra den lagerførte methylenopløsning, en stamopløsning af methylenblåt, som havde stået i over to måneder med mug på. Muggen og henstandstiden havde delvist demethyleret farvestoffet. Det vidste Romanowsky ikke, og han kunne ikke styre det, og andre forskere, som prøvede hans metode, kunne ikke få den lilla farve frem. Hans afhandling var blevet indleveret i Sankt Petersborg i juni 1891, og derfor regner den gængse fremstilling 1891 som opdagelsesåret.

Malachowskis demonstration havde fundet sted i juni 1890, over et år tidligere, og hans metode virkede som tilsigtet.

Hvorfor navnet kom fra den forkerte mand

Argumenterne for Malachowski blev samlet af Kristine Krafts, Ernst Hempelmann og Barbara Oleksyn og bygger på fire forhold. Datoen for den offentlige demonstration, juni 1890 over for september 1891. Ordet bevidst over for ordet tilfældig. Det forhold, at Malachowski offentliggjorde sin metode, inklusive boraks, mens Romanowskys afhang af en ukontrolleret variabel. Og den observation, at beskrivelsen af plasmodiets kerne sammen med den lilla farve, der gjorde den synlig, i praksis forsvandt fra litteraturen i syv år, fordi ingen kunne reproducere den tilfældige version.

De udtrykker konklusionen uden omsvøb. I den biografiske artikel kalder de tilskrivningen "en parodi", og de citerer Ralph Lillie, som i 1978 skrev, at "måske bør vi kalde denne familie af farvninger for Malachowski-farvninger".

Påstanden er omstridt, som påstande om førsteret til en opdagelse ofte er, og stridens karakter er værd at forklare frem for at afgøre. En diskussion om førsteret må fastslå, hvad opdagelsen var. Hvis opdagelsen er den lilla farve, har Malachowski den tidligste dokumenterede demonstration. Hvis opdagelsen er den offentliggjorte metode, offentliggjorde begge mænd deres arbejde i 1891, og farvningen blev opkaldt efter Romanowsky. Hvis opdagelsen er forklaringen, kan ingen af dem gøre krav på den, for ingen af dem vidste, at modning var demethylering, og ingen af dem kunne sige, hvorfor farven overhovedet opstod. Det sidste punkt er det, populære fremstillinger springer over. Den aktive bestanddel var en urenhed, som ingen havde identificeret, og den første person, der bevidst frembragte farven, gjorde det ud fra en reproducerbar empirisk opskrift, ikke ud fra en forståelse af, hvad opskriften gjorde.

De to artikler fra 2011 er den mest udførlige offentliggjorte fremstilling af argumenterne for Malachowski, og begge kan læses gratis via PubMed: den lange oversigtsartikel ved PMID 21235291 og den biografiske artikel ved PMID 21660627. PubMed-posten for oversigtsartiklen angiver også en kommentar til den, udgivet i samme tidsskrift senere samme år i 86(5):366, hvilket er en rimelig påmindelse om, at argumentet blev udfordret på tryk, så snart det blev fremsat.

Striden handler ikke om uenighed om kemien. Alle involverede er enige om, hvad den lilla farve er, og hvilke bestanddele der frembringer den. Uenigheden handler om, hvem der nåede frem først, og om en tilfældighed, som ingen kunne gentage, overhovedet tæller som at være nået frem.

Hvad de senere navne bidrog med

Hvis Malachowski frembragte den lilla farve først, hvorfor bærer farvningen så Romanowskys, Wrights og Giemsas navne?

Fordi en farvning, der virker én gang i hænderne på sin opfinder, ikke er et reagens. Det senere arbejde gjorde en lunefuld blanding til noget, en tekniker i et andet land kunne bruge på en tirsdag.

Nocht nåede frem gennem ræsonnement. Efter ikke at have fået et pålideligt resultat med et enkelt neutralt farvestof konkluderede han, at den lilla farve måtte komme fra noget i methylenblåt, som ikke var methylenblåt, og begyndte at lede efter det. Unna havde allerede bemærket, at ældede opløsninger af methylenblåt farvede mastcellers granula røde, og foreslog, at der blev dannet et nyt stof, mens farvestoffet modnede. Bernthsen havde i 1885 vist, at alkaliske forhold fjerner methylgrupper fra methylenblåt, og at disse produkter er det, vi nu kalder azurfarvestofferne. Nocht ekstraherede den aktive fraktion med kloroform og kunne kun kalde den rødt fra methylenblåt; Michaelis gav den navnet azur I i 1901. Jenner løste logistikken. Genopløsning af bundfaldet af methylenblåt og eosin i absolut methanol gav én stabil opløsning, som fikserede udstryget, mens den farvede det, og gjorde varmefiksering overflødig. Leishman og Reuter kombinerede polykromeret farvestof med et alkoholisk opløsningsmiddel og opnåede både stabilitet og den lilla farve. Wright erstattede en tolv timers inkubation ved 65 °C og ti dages henstand med en time i strømmende damp. Giemsa holdt helt op med at være afhængig af en tilfældigt modnet opløsning og brugte afmålte mængder af kendte farvestoffer med glycerol i methanolen, så produktet kunne tåle tropisk varme. Han offentliggjorde aldrig, hvordan han fremstillede rent methylenazur. Han solgte det til Dr. Grüblers laboratorium i Leipzig, som markedsførte det som azur I og hævdede, at kun deres version var autentisk Giemsa-farvning.

Identiteten af dette azurfarvestof er stadig omdiskuteret. Nogle mener, at det blot var polykromeret methylenblåt, andre at det var rigt på azure B. Svaret kom som følge af en krig. Da tyske farvestoffer ikke længere kunne skaffes, fandt et hold fra United States Public Health Service, Ralph Lillie sammen med Maurice Roe og Aimee Wilcox, at den bedste farvning kom fra tre adskilte bestanddele: umodificeret methylenblåt, dets demethylerede nedbrydningsprodukt azure B og eosin. Azure B erstattede det utilgængelige azur I, og disse tre bestanddele er stadig grundlaget for den farvning, der i dag bruges til at diagnosticere malaria.

Kemien bag disse tre bestanddeles samspil på et objektglas er et særskilt spørgsmål og emnet for en anden side. Farvestoffernes roller og kemien i farvninger af Romanowsky-typen beskriver, hvad azure B og eosin hver især gør, og hvorfor parret frembringer en farve, som ingen af dem frembringer alene. Siden om mikroskopi og laboratorieanvendelser dækker den praktiske side: hvad et givent præparat viser, og hvordan man vurderer, om et bestemt produkt er egnet til den metode, man vil bruge.

Den del af historien, der stadig er aktuel

Én detalje i denne historie holdt ikke op med at være relevant i 1902. I omtrent halvtreds år var den vigtigste bestanddel i verdens standardfarvning til malaria en unavngiven urenhed. Den var der ved et tilfælde, mængden varierede fra flaske til flaske, dens identitet var en forretningshemmelighed i en del af perioden, og dens andel blev diskuteret helt frem til 1940'erne. De mennesker, der brugte farvningen, var ikke skødesløse. De havde ingen mulighed for at vide, hvad der var i flasken.

Den moderne udgave af det samme problem er en specifikation, der kun beskriver en del af materialet. Overensstemmelse med USP er vejen til den højeste renhed, markedet tilbyder, fordi det er en fuldstændig offentliggjort standard snarere end en enkelt måling: identitet, renhed, organiske urenheder inklusive azurfarvestofferne, rester af opløsningsmidler, grundstofurenheder, gløderest, mikrobiologiske grænseværdier og bakterielle endotoksiner. Blupreme får sit methylenblåt fra en farmaceutisk producent og offentliggør det fulde analysecertifikat, så hver linje på listen kan kontrolleres frem for blot at blive påstået. Et certifikat, der angiver et resultat for tungmetaller og kalder det overensstemmelse med USP, er nutidens sidestykke til en flaske mærket "modnet methylenblåt": muligvis et udmærket reagens, men etiketten fortæller ikke, hvad der er i det.