Aflæsning af E. coli og andre koloniers udseende på EMB-agar

En studerende udstryger en ukendt prøve på eosin-methylenblåt-agar, inkuberer den natten over og vender tilbage til en plade med mørke kolonier med et grønt skær. I laboratoriejournalen står der "E. coli, bekræftet." Det notat hævder mere, end pladen kan underbygge. Pladen viser en vækst- og fermenteringsfænotype under bestemte betingelser. Artsidentiteten er en særskilt påstand, som kræver særskilt dokumentation.

Denne vejledning behandler resultater på EMB-agar som en fortolkningsopgave. Den forklarer det bagvedliggende princip, gennemgår et illustrativt pladeatlas med kontroller og beskriver de tilfælde, hvor lærebogens billede er misvisende.

Princippet bag pladen

EMB-agar er både selektiv og differentierende. Farvestofferne eosin Y og methylenblåt hæmmer mange grampositive organismer, så mediet favoriserer gramnegativ vækst. De samme farvestoffer fungerer som indikatorer: Når en organisme fermenterer det tilgængelige sukker og producerer tilstrækkeligt med syre lokalt, optager kolonien store mængder farvestof og bliver mørklilla til blåsort. Ved kraftig syreproduktion kan koloniens overflade vise en metallisk grøn irisering. ASM's protokol for eosin-methylenblåt-agarplader beskriver denne kombination af selektion og differentiering og indeholder referencefotografier til undervisning.

Én detalje er vigtig, før et resultat aflæses: Kontrollér, hvilken formulering der anvendes. Den ældre Holt Harris Teague-formulering indeholder både laktose og sukrose, mens Levine EMB kun indeholder laktose. En organisme, der fermenterer sukrose, men ikke laktose, såsom mange Serratia marcescens-isolater, kan se forskellig ud på de to versioner. Producentens dokumentation for EMB-medier angiver udtrykkeligt denne forskel i formulering. Notér producenten og formuleringen i laboratoriejournalen sammen med resultatet.

Færdigtilberedt, upodet EMB-agar er typisk rødbrun til rødlilla, undertiden med et grønligt skær eller et fint bundfald. Denne baggrundsfarve er ikke vækst. Sammenlign hver aflæsning med en upodet plade eller det dokumenterede udgangsudseende, og aflæs den primære plade efter cirka 18 til 24 timers aerob inkubation ved 35 til 37 C, medmindre undervisningsprotokollen angiver andet. Længere inkubation kan ændre fermenteringens udseende.

Sådan undersøges pladen

Brug to typer belysning. Undersøg først pladen i reflekteret eller skråt indfaldende lys, og vip den: Den metalliske glans er iriserende og kan fremtræde eller forsvinde afhængigt af betragtningsvinklen. Undersøg den derefter i gennemfaldende lys for at vurdere kolonifarve og mørke centre. Tag udgangspunkt i velisolerede kolonier, da tæt vækst og nabokolonier ændrer den lokale syreophobning og kan dæmpe eller forstærke farven. ASM's billedserie viser dette direkte: E. coli i blandingskultur kan miste sin forventede glans, fordi de omgivende organismer ændrer syremiljøet.

Medtag kontroller, når øvelsen tillader det. Et almindeligt kontrolsæt til undervisning er E. coli ATCC 25922 til den blåsorte fænotype med metallisk glans, en ikke-fermenterende organisme såsom Salmonella Typhimurium ATCC 14028 eller Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 til den farveløse fænotype og en grampositiv organisme såsom Enterococcus faecalis eller Staphylococcus aureus som hæmningskontrol, som angivet i standardtabeller for kvalitetskontrol af EMB-medier. Hvis den positive kontrol mangler glans, bør inkubation, tæt vækst eller formulering mistænkes, før den ukendte prøve mistænkes.

Illustrativt pladeatlas

Pladerne nedenfor er genererede illustrationer, ikke fotografier af virkelige kulturer. De viser det mønster, man skal se efter, ikke den præcise farvenuance for en bestemt stamme. Sammenlign dem med ASM's referencefotografier og med virkelige plader fra undervisningslaboratoriet.

Plade 1: Escherichia coli på EMB-agar, kraftigt laktosefermenterende

E. coli på EMB-agar er typisk mørklilla til blåsort, ofte med et mørkt centrum og en metallisk grøn glans fra kraftig syreproduktion. Glansen er det velkendte fund, som studerende leder efter, men betragt den som understøttende evidens snarere end som en definition. Glansens intensitet varierer med stamme, inkubationstid, kolonitæthed og betragtningsvinkel. Fravær af glans udelukker ikke E. coli, og en mørk koloni uden glans kan pege på flere andre fermenterende organismer. Vælg en velisoleret koloni til videre undersøgelser frem for at aflæse et område med tæt vækst.

Plade 2: Klebsiella pneumoniae på EMB-agar, slimet fermenterende organisme

Klebsiella pneumoniae på EMB-agar danner typisk store, skinnende, slimede kolonier i lyserøde til lilla eller brunlilla nuancer, ofte med mørke centre, men som regel uden en kraftig metallisk glans. En lignende morfologi forekommer hos beslægtede fermenterende organismer såsom Enterobacter. Slimet konsistens og kolonistørrelse indgår i aflæsningen: En lyserød koloni, der er lille og flad, har en anden betydning end en stor, kuppelformet og slimet koloni. Ligesom for E. coli peger pladen på en fermenteringsfænotype, og identifikation på artsniveau kræver den biokemiske bekræftelse, der beskrives nedenfor.

Plade 3: Salmonella på EMB-agar og andre ikke-fermenterende organismer, farveløse kolonier

Salmonella på EMB-agar og beslægtede ikke-laktosefermenterende organismer, herunder Shigella og mange Pseudomonas-isolater, vokser typisk som farveløse til gennemskinnelige eller svagt ravfarvede kolonier. Visse formuleringer og betingelser giver et svagt lyserødt skær, så en bleg lyserød koloni er ikke automatisk fermenterende. EMB skelner ikke Salmonella fra Shigella eller fra andre ikke-fermenterende organismer; den skelnen hører til senere undersøgelser. Bemærk også, at der er dokumenteret laktosepositive Salmonella-stammer med metalliske kolonier, der ligner E. coli, hvilket er endnu en grund til, at en enkelt plade ikke kan afgøre sagen.

Plade 4: Serratia marcescens og formuleringens faldgrube

Serratia marcescens får sit eget afsnit, fordi studerende ofte forventer røde kolonier og derfor fejlfortolker pladen. De fleste kliniske isolater fermenterer ikke laktose, så på Levine EMB fremstår de ofte blege til svagt farvede. Da mange isolater fermenterer sukrose, kan en sukroseholdig formulering give en mørkere eller mere syrerelateret reaktion. Forvent heller ikke det klassiske røde prodigiosinpigment ved 35 til 37 C; pigmentproduktionen er upålidelig ved inkubatortemperatur. Når protokollen omtaler Serratia marcescens på EMB-agar, skal du kontrollere, hvilken formulering udsagnet forudsætter. En oversigtsartikel om Serratias stofskifte opsummerer det laktosenegative og sukrosevariable mønster bag denne faldgrube.

Plade 5: kontroller og hæmmede organismer

Grampositive organismer såsom Staphylococcus, Enterococcus, Streptococcus og Bacillus hæmmes generelt eller får deres vækst markant undertrykt på EMB-agar, selv om hæmningen ikke er fuldstændig for alle stammer. Et kontrolpanel sikrer en retvisende aflæsning: E. coli-kontrollen bør vise god vækst med blåsort farve og glans, den ikke-fermenterende kontrol bør vise farveløs vækst, og hæmningskontrollen bør vise ringe eller ingen vækst. Hvis hæmningskontrollen vokser godt, har selektionen svigtet, og alle øvrige aflæsninger fra det pågældende parti er tvivlsomme. Farvningsmetoder besvarer et andet spørgsmål end dyrkningsmedier; for laboratoriets objektglasfarvning, se atlasset over farvning med methylenblåt.

Sammenligning med klare begrænsninger

Tre sætninger opsummerer de misvisende udseender. Mørk er ikke lig med E. coli, da Klebsiella, Enterobacter og andre fermenterende organismer udvikler mørke centre uden glans. Lyserød er ikke lig med Klebsiella, da moderat eller langsomt fermenterende organismer og nogle organismer, der normalt regnes som ikke-fermenterende, fremstår lyserøde eller lavendelfarvede. Glans er ikke lig med endeligt bekræftet E. coli, da andre kraftigt fermenterende organismer kan frembringe den. Undervisningsprotokollen og dens billeder af blandingskulturer illustrerer hver af disse fejlslutninger.

Grænser for bekræftelse

EMB-agar viser en fænotype, ikke en art. Forskellige organismer kan have samme koloniudseende, og en organisme kan afvige fra sit lærebogsbillede afhængigt af stamme, alder, tæt vækst, formulering og inkubation. Derfor betragtes EMB-morfologi som et foreløbigt grundlag for identifikation i både undervisning og kliniske arbejdsgange.

En fagligt forsvarlig arbejdsgang for studerende er: Beskriv den isolerede koloni (størrelse, farve, centrum, glans i skråt indfaldende lys, slimet karakter), notér formulering, inkubationstid og temperatur samt kontroller; ompod derefter en velisoleret koloni til renkultur før enhver bekræftende undersøgelse. Almindelige opfølgende undersøgelser omfatter gramfarvning og IMViC-reaktioner til foreløbig identifikation af E. coli og koliforme bakterier, TSI eller KIA og organismespecifikke biokemiske paneler til enteriske organismer samt serologisk identifikation, MALDI TOF eller anden valideret identifikation, hvor opgaven kræver det. For baggrund om EMB's rolle blandt selektive og differentierende medier til enteriske organismer, se introduktioner til enteriske dyrkningsmedier og opfølgning med gramfarvning. For det beslægtede spørgsmål om, hvad en blå farvning på et objektglas kan og ikke kan bevise, holder atlasset over farvning med methylenblåt på samme måde observation og konklusion adskilt.

Skriv observationen før konklusionen. "Mørke blåsorte kolonier med vinkelafhængig grøn glans på Levine EMB efter 24 timer, foreneligt med kraftig laktosefermentering" er fagligt forsvarligt. "E. coli, bekræftet" kræver det bekræftende trin, som pladen alene ikke kan levere.