A all glas methylen osgoi Cymhlyg III mitocondriaidd? Pam mae astudiaethau'n anghytuno

Gofynnodd dau labordy a all glas methylen osgoi Cymhlyg III mitocondriaidd sydd wedi'i flocio. Atebodd un na all. Atebodd y llall y gall. Roedd gan y ddau ddata.

Canfu'r astudiaeth gyntaf, mewn mitocondria ymennydd llygod, na all y llifyn wneud hynny. Canfu'r ail, mewn mitocondria ymennydd o dair rhywogaeth o gnofilod, y gall wneud hynny'n rhannol. Mae trydedd astudiaeth, yn iau llygod, yn aml yn cael ei dyfynnu ochr yn ochr â nhw ond profodd rywbeth arall. Cadwch hi yn ei lle priodol ac mae hanner y dryswch yn diflannu.

Nid oes mecanwaith cyffredinol i'w gyhoeddi. Mae tri arbrawf gydag atalyddion, dosau a mesuriadau gwahanol. Darllenwch yr amodau yn gyntaf. Mae'r casgliadau'n dilyn.

Beth mae osgoi yn ei olygu yma

Mae electronau'n mynd i mewn i'r gadwyn drwy Gymhlyg I (o NADH) neu Gymhlyg II (o swcsinad), yn pasio drwy Gymhlyg III i cytocrom c, yna drwy Gymhlyg IV i ocsigen. Y graddiant sy'n cael ei adeiladu ar hyd y ffordd yw'r hyn y mae'r gell yn ei ddefnyddio i wneud ATP.

Mae honiad am lwybr osgoi yn dweud bod glas methylen yn casglu electronau cyn man blocio ac yn eu rhyddhau ar ei ôl. Mae'r llifyn ocsidiedig yn derbyn electronau o NADH neu gydrannau cynnar y gadwyn, gan droi'n las lewcomethylen, ac mae'r ffurf rydwythiedig yn eu trosglwyddo i cytocrom c neu'n ôl i'r gadwyn. Os yw'r trosglwyddiad yn digwydd ar ôl y man blocio, mae resbiradaeth a photensial y bilen yn adfer yn rhannol. Os yw'n digwydd yn y man blocio neu cyn hynny, nid oes dim yn adfer.

Mae un manylyn am Gymhlyg III yn penderfynu llawer o'r anghydfod hwn. Mae'r cymhlyg yn gweithredu cylch Q gyda dau safle atalydd. Mae antimycin yn rhwymo wrth safle Qi. Mae myxothiazol yn rhwymo wrth safle Qo. Dim ond hanner y cymhlyg y mae astudiaeth sy'n defnyddio un ohonynt yn unig wedi'i brofi.

Astudiaeth un: dim llwybr osgoi mewn mitocondria ymennydd llygod

Defnyddiodd Gureev a chydweithwyr fitocondria cortecs o lygod C57BL/6, wedi'u hynysu â digitonin, a'u profi ar 0.1 mg o brotein fesul ml. Roedd y swbstradau'n cwmpasu tair trefn: pyrwfad ynghyd â malad ar 5 mM yr un, swcsinad ar 10 mM gyda glwtamad ar 2 mM, ac L-prolin ar 10 mM. Yr atalyddion oedd rotenone ar 1 micromolar (Cymhlyg I) ac antimycin ar 1 microgram fesul ml (Cymhlyg III). Dosau'r llifyn oedd 0.5, 1, a 2 micromolar, gydag 1 micromolar yn brif grynodiad. Mae'r dulliau a'r olion mesur yn y cyfathrebiad yn FEBS Letters.

Gweithiodd y llwybr osgoi Cymhlyg I. Gostyngodd rotenone resbiradaeth a ysgogwyd gan ADP o tua 121 i tua 2 nmol fesul munud fesul mg, ac adferodd 1 micromolar o'r llifyn hi i tua 21. Adferodd potensial y bilen gyda phyrwfad ynghyd â malad a chydag L-prolin.

Ni weithiodd y llwybr osgoi Cymhlyg III. Gostyngodd antimycin resbiradaeth i tua 16, a dim ond i tua 20 y symudodd y llifyn hi. Ni adferodd potensial y bilen ar unrhyw swbstrad, gyda dosau llifyn hyd at 5 micromolar. Roedd data perocsid yn awgrymu'r un peth: cododd y llifyn ar ei ben ei hun allyriad perocsid o gyfradd sylfaenol o tua 76 pmol fesul munud fesul mg i tua 1170, 1460, a 1945 ar y tri dos, ond gostyngodd antimycin y signal hwnnw a yrrwyd gan y llifyn tua 25, 88, a 96 y cant yn y drefn honno. Pe bai'r llifyn rhydwythiedig yn adweithio'n uniongyrchol ag ocsigen, ni ddylai blocio Cymhlyg III atal y signal. Daeth yr awduron i'r casgliad bod y llifyn rhydwythiedig yn cael ei ocsidio yn safle Qo Cymhlyg III, cyn y man blocio gan antimycin. Y ddolen fer, mewn geiriau: rhoddwyr i'r llifyn, y llifyn i Qo, y llwybr arferol ymlaen. Mae rotenone yn cael ei osgoi. Nid yw antimycin.

Astudiaeth dau: llwybr osgoi rhannol mewn tair rhywogaeth, yn y ddau safle atalydd

Ehangodd Svab a chydweithwyr y cynllun. Mitocondria ymennydd o lygod, llygod mawr a moch cwta, wedi'u hynysu â Percoll, a'u profi ar yr un 0.1 mg fesul ml, gyda phyrwfad ynghyd â malad neu glwtamad ynghyd â malad ar 5 mM yr un. Defnyddiwyd dau atalydd Cymhlyg III: antimycin A ar 0.3 micromolar a myxothiazol ar 1 micromolar. Roedd y llifyn ar 2 micromolar yn y rhan fwyaf o'r profion, ac ar 0.5 yn y gwaith cytocrom c. Mae'r tair rhywogaeth gyda phrotocolau cyfatebol yn y papur mynediad agored.

Cafodd y ddau fan blocio eu hosgoi'n rhannol, ym mhob un o'r tair rhywogaeth. Mewn mitocondria llygod, ataliodd antimycin resbiradaeth a chododd y llifyn hi tua 60 y cant, o tua 37 i 59 nmol fesul munud fesul mg. Ataliodd myxothiazol hi 88 y cant, i tua 4.5, a chododd y llifyn hi bum gwaith i tua 23. Ailbolareiddiodd potensial y bilen yn rhannol o dan y naill atalydd neu'r llall, wedi'i fesur â dau lifyn (safranin O a TMRM cymhareb-fetrig) i ddiystyru arteffactau optegol.

Profodd y papur hwn y trosglwyddiad yn uniongyrchol hefyd, rhywbeth na wnaeth yr astudiaeth gyntaf erioed. Ni chafodd cytocrom c asetyleiddiedig alldarddol ar 25 micromolar ei rydwytho gan fitocondria egniol, gydag atalyddion neu hebddynt, ond ysgogodd ychwanegu'r llifyn rydwythiad yn y ddau achos. Mewn byffer heb gelloedd, rhydwythodd NADH ynghyd â'r llifyn cytocrom c ar gyfradd a oedd yn gymesur â NADH. Y naid hirach, mewn geiriau: cyfwerthoedd rhydwytho i'r llifyn, y llifyn yn uniongyrchol i cytocrom c, Cymhlyg IV i ocsigen. Mae'r llwybr hwnnw'n hepgor Cymhlyg III yn llwyr, felly gellir osgoi'r ddau atalydd.

Mae dau fesuriad ychwanegol yn cefnogi'r dehongliad hwnnw. Gostyngodd fflworoleuedd NAD(P)H pan ychwanegwyd y llifyn at fitocondria a driniwyd â myxothiazol, gan olygu bod cyfwerthoedd rhydwytho yn draenio drwy'r llwybr newydd. Ac roedd amsugnedd y llifyn ar 660 nm yn olrhain pob ychwanegiad yn ei dro, tra dangosodd uwchnatantau wedi'u hallgyrchu fod crynodiad y llifyn ocsidiedig y tu mewn i fitocondria egniol yn cynyddu dros ganwaith, ac yna fod y llifyn yn gadael pan gwympodd y potensial. Mae'r cyfrif protonau'n cyd-fynd hefyd: mae hepgor y camau pwmpio yn gadael tua 2 broton fesul pâr o electronau yn hytrach na 10, felly defnydd cyflymach o ocsigen gydag ailbolareiddio rhannol yn unig yw'r hyn y mae llwybr osgoi gwirioneddol yn edrych fel, nid tystiolaeth yn ei erbyn.

Cynhyrchodd yr un paratoad ymatebion sy'n cosbi darllen diofal. Gyda'r atalydd a'r llifyn, gostyngodd ADP resbiradaeth yn hytrach na'i chodi, ac ysgogodd blocio cludiant hi yn hytrach na'i harafu, tra oedd potensial y bilen yn dal i symud i'r cyfeiriadau arferol. Mae defnydd o ocsigen ar ei ben ei hun yn gamarweiniol yn y system hon.

Astudiaeth tri: yr astudiaeth o'r iau a brofodd Gymhlygau I a II, nid III

Defnyddiodd Lee a Boelsterli fitocondria iau llygod a hepatocytau mewn meithriniad wedi'u niweidio gan efavirenz (Cymhlyg I, IC50 tua 30 micromolar) a hydrasin, metabolyn isoniazid (Cymhlyg II, IC50 tua 30 micromolar). Adferodd y llifyn ar tua 30 micromolar ocsidiad NADH, potensial y bilen ac ATP, gan leihau ocsidyddion a marwolaeth necrotig. Mae'r papur yn Redox Biology yn modelu hyn fel y llifyn yn cludo electronau o amgylch y Cymhlygau I a II sydd wedi'u niweidio.

Mae'r canlyniad hwnnw'n gyd-destun sefydledig ar gyfer y rhan gynharach o'r gadwyn, ac nid yw'n dweud dim am Gymhlyg III oherwydd na chafodd dim ei flocio yno. Ni all gadarnhau na gwrthbrofi'r naill astudiaeth ymennydd na'r llall.

Y matrics amodau

Pedwar rheswm pam y gall y ddwy astudiaeth Cymhlyg III fod yn gywir am eu trefniant eu hunain

1. Nid oedd yr atalydd yn un a'r un ymyriad. Antimycin ar ei ben ei hun ar 1 microgram fesul ml o'i gymharu ag antimycin ar 0.3 micromolar ynghyd ag atalydd safle Qo ar wahân. Mae llwybr llifyn sy'n bwydo safle Qo yn methu yn union lle mae llwybr uniongyrchol i cytocrom c yn llwyddo. Ni all un safle gynrychioli'r ddau.

2. Roedd dos ac amseriad y llifyn yn wahanol. Prif grynodiadau o 1 o'i gymharu â 2 micromolar, mewn sylwedd sy'n cylchu rhwng cyflyrau rhydocs ac y mae ei fewnlifiad a'i rydwythiad uniongyrchol o cytocrom c yn dibynnu ar grynodiad ac amser. Gall gwahaniaethau bach mewn dos ynghyd ag amseru mesuriadau'n wahanol amlygu canghennau gwahanol o un rhwydwaith.

3. Roedd y paratoadau'n wahanol. Mae ynysu â digitonin o'i gymharu ag ynysu drwy raddiant Percoll yn dethol poblogaethau mitocondriaidd sy'n gorgyffwrdd ond nad ydynt yn union yr un fath. Roedd crynodiad y protein yn cyfateb ar 0.1 mg fesul ml, felly gellir diystyru'r newidyn hwnnw, ond nid yr isboblogaeth na'r cyfanrwydd. A chafodd rhywogaeth ei diystyru fel achos: atgynhyrchodd yr ail grŵp ei ffenoteip mewn llygod hefyd.

4. Mae cyflwr y swbstrad yn pennu beth y gall y llifyn ei wneud. Tair trefn swbstrad o'i gymharu â pharau cysylltiedig â NADH. Mae cyflenwad NADH a photensial y bilen gyda'i gilydd yn pennu pa mor gyflym y mae'r llifyn yn cael ei rydwytho a ble mae'n ymrannu, ac mae llwybr sydd angen llifyn rhydwythiedig wrth ymyl cytocrom c ocsidiedig yn dibynnu ar y dewis hwnnw.

Sut i ddarllen yr honiad nesaf am lwybr osgoi

Gofynnwch pa gymhlyg a gafodd ei flocio, gyda pha atalydd, ym mha safle ac ar ba ddos. Gofynnwch am grynodiad y llifyn a phryd y cymerwyd y mesuriad. Gofynnwch am y feinwe, y rhywogaeth, y dull ynysu, crynodiad y protein a'r swbstrad. A gofynnwch a yw potensial, resbiradaeth, cyflwr rhydocs a phrawf trosglwyddo uniongyrchol yn cytuno, oherwydd awgrymodd defnydd o ocsigen ar ei ben ei hun y cyfeiriad anghywir fwy nag unwaith yma.

Mae'r crynodeb cul yn dal. Mae osgoi Cymhlyg I drwy'r llifyn yn fater y cytunir arno. O amgylch Cymhlyg III, nid yw mitocondria llygod gydag antimycin ar 1 microgram fesul ml a'r llifyn ar 1 micromolar yn dangos llwybr osgoi swyddogaethol, tra bod tair rhywogaeth gydag antimycin ar 0.3 micromolar neu myxothiazol ar 1 micromolar a'r llifyn ar 2 micromolar yn dangos llwybr osgoi rhannol gyda throsglwyddiad uniongyrchol o'r llifyn i cytocrom c. Gall y brawddegau hynny gydfodoli. Allosodiad yw unrhyw beth ehangach.

Mae darllen cysylltiedig yn cadw'r honiad dadleuol o fewn cemeg nad oes anghydfod yn ei chylch: sut mae glas methylen yn symud electronau ar gyfer y trosglwyddo fesul cam, yr arbrofion ar osgoi Cymhlyg I ar gyfer yr achos sefydledig yn rhan gynharach y gadwyn, mesuriadau potensial y bilen a'u harteffactau ar gyfer pam roedd angen dau lifyn, a thrin sylweddau sy'n cylchu rhwng cyflyrau rhydocs yn y labordy ar gyfer y maglau dos ac amseriad.