Glas methylen a fferoptosis: mecanwaith perocsidiad lipidau

Marwolaeth celloedd oherwydd niwed i bilenni yw fferoptosis. Mae brasterau amlannirlawn mewn pilenni yn ocsidio mewn adwaith cadwynol, mae'r bilen yn methu, ac mae'r gell yn marw. Mae angen haearn ar gyfer y cemeg. Y frawddeg honno yw'r cysyniad cyfan, ac mae popeth yn yr erthygl hon yn brawf o un rhan ohono.

Mae'r cwestiwn yma'n fwy penodol: beth mae glas methylen yn ei wneud i'r gadwyn honno mewn arbrofion ar gelloedd, a beth mae'r canlyniad hwnnw'n ei ddangos mewn gwirionedd? Yr ateb byr yw bod glas methylen ar grynodiadau nanomolar wedi lleihau perocsidiad lipidau mitocondriaidd mewn dwy astudiaeth labordy, ac wedi cadw celloedd yn fyw ar ôl sbardunau sydd fel arall yn achosi fferoptosis. Mae'r ateb hwy yn bwysicach, oherwydd profwyd pob dolen yn y gadwyn gydag ymyriad gwahanol, ac mae gan bob ymyriad ei gyfyngiadau.

Fferoptosis mewn un paragraff

Mae gan ffosffolipid mewn pilen sy'n cario cynffon asid brasterog amlannirlawn fan gwan: atomau hydrogen sy'n hawdd eu dwyn. Unwaith y bydd radical yn dwyn un, mae ocsigen yn ymlynu wrth y lipid, mae radical perocsyl lipid yn ffurfio, ac mae'r radical hwnnw'n dwyn o'r lipid nesaf. Mae'r adwaith yn ymledu ar hyd y bilen oni bai bod rhywbeth yn ei atal.

Y prif fecanwaith atal yw ensym o'r enw GPX4, sy'n defnyddio glutathion i rydwytho perocsidau lipid i alcoholau lipid diniwed. Mae sbardunau labordy yn ymosod ar yr amddiffyniad hwn mewn mannau penodol. Mae erastin yn rhwystro mewnforio cystin drwy system xc-minus, gan amddifadu'r gell o'r cystein sydd ei angen i syntheseiddio glutathion. Mae swlffocsimin bwthionin yn rhwystro synthesis glutathion yn uniongyrchol. Mae RSL3 yn atal GPX4 ei hun. Mae'r tri yn gadael perocsidau heb eu dileu, ond maent yn gwneud hynny ar gamau gwahanol, felly nid yw canlyniad gydag un sbardun yn berthnasol yn awtomatig i'r lleill.

Mae fferoptosis yn wahanol i apoptosis o ran y priodweddau sy'n ei ddiffinio. Nid oes rhaeadr caspasau na chyrff apoptotig. Mae cyfryngau sy'n cheladu haearn, megis deferoxamine, a chyfryngau sy'n dal radicalau, megis ferrostatin-1, yn ei atal. Dyma'r prawf gweithredol y mae ymchwilwyr yn ei ddefnyddio i alw marwolaeth yn fferoptotig yn hytrach nag yn necrotig yn unig. Mae'r ystod ehangach o lwybrau marwolaeth celloedd reoledig yn rhoi'r gwahaniaeth hwn mewn cyd-destun, ac mae'r ffordd y mae celloedd yn trin haearn labiliol yn esbonio pam mae cheladu yn rheolydd mor bendant.

Ble mae mitocondria yn ffitio, a pham roedd anghydfod ynghylch hynny

Nododd gwaith cynnar fod celloedd heb DNA mitocondriaidd yn dal i fynd drwy fferoptosis, gan awgrymu nad oedd mitocondria yn hanfodol. Canfu gwaith diweddarach y gall lleihau nifer y mitocondria, neu rwystro resbiradaeth, atal fferoptosis sy'n deillio o brinder cystein ond nid o atal GPX4 yn uniongyrchol. Gall y ddau ganlyniad fod yn wir os yw cyfraniad y mitocondria yn dibynnu ar y sbardun, y math o gell, a lle mae'r perocsidiad tyngedfennol yn digwydd.

Aeth yr astudiaeth sy'n sail i'r erthygl hon i'r afael â'r anghydfod gan ddefnyddio chwiliedydd sy'n benodol i adran o'r gell. Mae MitoCLox yn fersiwn o ddangosydd perocsidiad lipidau sydd wedi'i dargedu at fitocondria: mae ei fflworoleuedd yn newid pan fydd yn dod ar draws radicalau perocsyl lipid y tu mewn i fitocondria. Mewn ffibroblastau a gafodd eu trin ag erastin, ymddangosodd ocsidiad y chwiliedydd mitocondriaidd mewn celloedd a oedd yn dal yn fyw cyn iddynt farw, ac roedd yn amrywio ar draws y boblogaeth. Mae'r amseriad hwnnw'n bwysig. Mae perocsidiad sy'n digwydd cyn marwolaeth yn achos posibl. Gweddillion yw perocsidiad a fesurir mewn celloedd marw yn unig. Mae canllaw cysylltiedig i brofion perocsidiad lipidau a'r hyn y mae pob chwiliedydd yn ei ddangos yn esbonio pam mae lleoliad y chwiliedydd yn penderfynu beth mae signal yn ei olygu.

Ymddangosodd yr un patrwm mewn ail fodel. Bu farw ffibroblastau o glaf â niwropathi optig etifeddol Leber, sy'n cario mwtaniad cymhlyg I ac sydd â straen ocsideiddiol sylfaenol uwch, drwy fferoptosis pan ddisbyddwyd glutathion, tra bod ffibroblastau rheoli yn gwrthsefyll. Unwaith eto, ocsidiad y chwiliedydd mitocondriaidd ddaeth gyntaf. Ceir y manylion yn yr astudiaeth ffibroblastau o berocsidiad lipidau mitocondriaidd mewn fferoptosis.

Beth newidiodd glas methylen yn yr arbrofion hyn

Cludydd rhydocs yw glas methylen. Mae ei ffurf ocsidiedig yn derbyn electronau o gemeg sy'n gysylltiedig â NADH yng nghymhlyg I, ac mae ei ffurf rydwythiedig yn eu rhoi i gytochrom c, sy'n bwydo cymhlyg IV. Mae hynny'n creu ffordd osgoi rannol o amgylch y rhan o'r gadwyn lle mae electronau fel arfer yn gollwng i ocsigen fel superocsid. Dylai darllenwyr sydd am gael y darlun llawn o'r trosglwyddo ddechrau gyda sut mae glas methylen yn symud electronau drwy fitocondria.

Mewn ffibroblastau ysgyfaint a gafodd eu trin ag erastin, cadwodd glas methylen ar grynodiad o 250 nanomolar y celloedd yn hyfyw mewn prawf goroesiad celloedd, ochr yn ochr â'r gwrthocsidyddion SkQ1 a MitoTEMPO sydd wedi'u targedu at fitocondria. Mae'r rheolyddion yn diffinio'r honiad. Roedd ferrostatin-1, alffa-tocofferol, a deferoxamine hefyd yn amddiffyn, sy'n cadarnhau bod y farwolaeth yn fferoptotig. Nid oedd yr analog SkQ1 heb grŵp gwrthocsidiol yn amddiffyn, sy'n pwyntio at gemeg rhydocs yn hytrach na chronni amhenodol. Gwanhaodd yr amddiffyniad uwchlaw tua 200 nanomolar SkQ1, yn gyson ag ymddygiad pro-ocsidiol hysbys gwrthocsidyddion cwinon ar lwythi uwch. Mae gan las methylen yr un ymddygiad deublyg yn ôl dos: mae'n amddiffyn ar lefelau nanomolar isel yn y dysglau hyn, ond gall gynhyrchu hydrogen perocsid drwy gylchu rhydocs pan godir y lefel neu pan gaiff ei oleuo'n gryf. Trafodir cyd-destun dos o'r math hwn yn rhywogaethau ocsigen adweithiol mewn mitocondria.

Yna gwahanodd yr arbrofion ar fitocondria ynysig ffynonellau'r ROS. Ym mhresenoldeb haearn(II), ysgogodd swbstradau sy'n bwydo cymhlyg I ynghyd â rotenone ocsidiad y chwiliedydd. Mae rotenone yn rhwystro'r gadwyn i lawr yr afon o'r safle fflafin, felly mae cludyddion i fyny'r afon yn aros yn rydwythiedig ac yn gollwng electronau i ocsigen o'r fflafin sy'n wynebu'r matrics. Cynhyrchodd swbstradau sy'n bwydo cymhlyg III ynghyd ag antimycin A lawer o hydrogen perocsid, ond ni wnaethant yrru perocsidiad lipidau. Yr un signal ROS cyffredinol, lleoliad gwahanol, canlyniad gwahanol. Ataliodd SkQ1 a glas methylen ill dau y perocsidiad a yrrwyd gan gymhlyg I heb atal cynhyrchu hydrogen perocsid ei hun. Mae hynny'n gosod eu gweithred ar ôl ffurfio ROS, ar gam perocsidiad lipidau.

Elfen y gorlwytho haearn a'r cliw lipoffwsgin

Gofynnodd ail astudiaeth y cwestiwn o safbwynt haearn. Datblygodd cardiomyocytau H9c2 a oedd yn agored i sitrad amoniwm haearn(III) ar grynodiadau is-filimolar ROS mitocondriaidd, perocsidiad lipidau mitocondriaidd, ac yna fferoptosis, ac ar ôl hynny cronni pigment tebyg i lipoffwsgin o fewn 24 awr. Lipoffwsgin yw'r gweddill hunanfflworoleuol sy'n cynnwys haearn ac sy'n deillio o lipidau a phroteinau ocsidiedig sy'n cronni gydag oedran. Mae ei ymddangosiad cyflym yma yn cysylltu perocsidiad acíwt a yrrir gan haearn â marciwr clasurol o heneiddio. Roedd glas methylen ar grynodiadau nanomolar a SkQ1 ill dau yn atal y perocsidiad, y farwolaeth, a chronni'r pigment. Cadarnhaodd mitocondria cardiaidd ynysig y patrwm: roedd rotenone ynghyd â haearn(II) yn gyrru perocsidiad a signal tebyg i bigment, ac roedd y ddau gyfrwng yn ei rwystro. Adroddir y dilyniant llawn yn yr astudiaeth o orlwytho haearn mewn cardiomyocytau H9c2. Mae ochr y pigment i'r stori yn perthyn gyda lipoffwsgin a marcwyr heneiddio celloedd.

Beth nad yw profion goroesiad celloedd yn ei ddangos

Mae darlleniad hyfywedd fel CellTiterBlue yn dangos faint o gelloedd mewn dysgl sy'n parhau'n weithredol yn fetabolig ar ôl sbardun ynghyd â chyfrwng amddiffynnol posibl. Prawf o fecanwaith mewn system ddiffiniedig yw hynny. Nid canlyniad triniaeth ydyw. Ni roddodd yr un o'r arbrofion hyn ddos i glaf, ni fesurwyd pwynt terfyn clefyd, ac ni sefydlwyd ffenestr therapiwtig mewn corff.

Mae pedwar cyfyngiad yn haeddu cael eu nodi'n benodol. Yn gyntaf, mae'r mathau o gelloedd yn gyfyngedig: ffibroblastau ysgyfaint wedi'u trawsnewid, ffibroblastau croen cynradd gan gynnwys un llinell â chlefyd mitocondriaidd, a llinell cardiomyocytau llygod mawr, ynghyd â mitocondria ynysig o galonnau llygod mawr. Roedd sensitifrwydd yn amrywio rhwng llinellau, a dewiswyd y llinell LHON oherwydd ei bod yn anarferol o agored i niwed. Yn ail, eithafion labordy yw'r sbardunau: rhwystro cludiant neu synthesis yn llwyr, a llwythi haearn na fyddai unrhyw feinwe yn dod ar eu traws yn acíwt. Yn drydydd, nid oes modd trosi crynodiad drwy luosi. Nid dos i berson yw crynodiad nanomolar mewn cyfrwng meithrin, ac mae dosbarthiad glas methylen, ei rydwytho i'w ffurf ddi-liw mewn gwaed a meinwe, amlygiad i olau, a photensial y bilen i gyd yn ffactorau sy'n gwahanu dysgl oddi wrth berson. Yn bedwerydd, mae'r chwiliedyddion yn dangos yr hyn sy'n digwydd yn eu hadran eu hunain. Mae ocsidiad MitoCLox yn dangos bod radicalau lipid mitocondriaidd wedi ffurfio; nid yw'n dangos bod rhwygo'r bilen blasma, sef y digwyddiad terfynol tebygol, wedi'i atal yn uniongyrchol yn hytrach na'i osgoi drwy weithredu i fyny'r afon.

Felly dyma'r honiad gonest: yn y modelau hyn, mae ROS sy'n deillio o gymhlyg I ynghyd â haearn yn gyrru perocsidiad lipidau mitocondriaidd sy'n digwydd cyn fferoptosis, ac mae glas methylen ar grynodiadau isel yn torri'r rhan honno o'r gadwyn. Mae angen arbrofion gwahanol mewn anifeiliaid ac yna mewn pobl ar gyfer unrhyw beth y tu hwnt i'r rhan honno.