Erthygl
Dewisiadau amgen i las methylen ar gyfer microsgopeg: dewiswch yn ôl y dasg
Ar gyfer taeniad bacteriol syml, gall fioled grisial gymryd lle glas methylen pan mai'r nod yw gweld siâp y celloedd. Ar gyfer celloedd byw, gallai'r dewis arall gwell fod yn gyferbyniad gwedd heb unrhyw staen o gwbl. Mae'r dewis yn dibynnu ar yr arsylwad y mae angen i chi ei wneud.
Tybiwch fod dau berson yn archwilio'r un meithriniad bacteriol. Mae un am wahaniaethu rhwng gwiail a chelloedd crwn. Mae'r llall am wybod a yw triniaeth wedi lladd y bacteria. Gall staen sy'n rhoi delwedd glir i'r person cyntaf beidio â rhoi unrhyw ateb defnyddiadwy i'r ail.
Cyn dewis amnewidyn, cwblhewch y frawddeg hon: “Mae angen i mi arsylwi ___ mewn ___, ac mae'n rhaid / nid oes angen i'r celloedd aros yn fyw.” Mae'r frawddeg honno'n diffinio'r gwaith y mae'n rhaid i'r staen ei wneud.
Dechreuwch gyda'r sbesimen a'r cwestiwn
Yn gyntaf, penderfynwch a oes rhaid i'r celloedd aros yn fyw, yna nodwch y nodwedd y mae angen i chi ei harsylwi:
- Mae'n rhaid i'r celloedd aros yn fyw: ar gyfer symudiad neu siâp, ystyriwch gyferbyniad gwedd heb staen neu DIC; ar gyfer DNA niwclear, ystyriwch Hoechst 33342 gyda fflworoleuedd; ar gyfer cyfanrwydd y bilen, dewiswch brawf wedi'i ddilysu megis SYTO 9 gyda propidium iodide.
- Nid oes angen i'r celloedd aros yn fyw: ar gyfer morffoleg facteriol, ystyriwch staen syml â fioled grisial neu staen negyddol nigrosin; ar gyfer adwaith Gram, defnyddiwch y dull staenio Gram cyflawn; ar gyfer DNA niwclear mewn celloedd sefydlog, ystyriwch fflworoleuedd DAPI. Defnyddiwch y tabl hwn i gymharu cyfyngiadau pob cangen. Dewisiadau dull yw'r rhain, nid cyfarwyddiadau i gyfnewid poteli o fewn protocol presennol.
| Yr hyn y mae angen i chi ei arsylwi | Sbesimen ac offer | Dewis arall posibl | Prif gyfyngiad |
|---|---|---|---|
| Siâp a threfniant bacteriol | Taeniad bacteriol wedi'i baratoi; maes llachar | Staen syml â fioled grisial | Yn dangos morffoleg; nid yw'n sefydlu adwaith Gram na hyfywedd. |
| Amlinellau celloedd yn erbyn cefndir tywyll | Paratoad bacteriolegol; maes llachar | Staen negyddol nigrosin | Mae'r paratoad a'r fformiwleiddiad yn bwysig; nid yw cell heb ei staenio o reidrwydd yn fyw. |
| Adwaith Gram | Taeniad bacteriol wedi'i baratoi; maes llachar | Dull staenio Gram cyflawn | Mae angen y dilyniant adweithyddion cyflawn a rheolyddion. |
| Symudiad neu newidiadau mewn celloedd byw | Paratoad gwlyb cydnaws; cyferbyniad gwedd neu DIC | Dim staen | Mae angen opteg addas; nid yw cyferbyniad yn adnabod moleciwl. |
| DNA niwclear | Celloedd sefydlog; fflworoleuedd | DAPI | Mae angen hidlyddion cyffroi ac allyrru cydnaws. |
| DNA niwclear mewn celloedd byw | Celloedd byw; fflworoleuedd | Hoechst 33342 | Nid yw mynediad i'r gell yn sefydlu bod yr amodau delweddu yn ddiniwed. |
| Cyfanrwydd pilen bacteriol | Bacteria heb eu sefydlogi; fflworoleuedd | SYTO 9 gyda propidium iodide | Mae staenio'r bilen yn fesur anuniongyrchol o hyfywedd. |
Ar gyfer taeniad syml, amnewidiwch y dull yn ofalus
Mae fioled grisial yn ddewis ymarferol pan mai'r dasg yw cael golwg unlliw ar forffoleg facteriol. Mae Llawlyfr Dadansoddol Bacteriolegol yr FDA yn rhestru dau fformiwleiddiad fioled grisial sy'n addas ar gyfer staenio syml. Defnyddiwch fformiwleiddiad wedi'i ddogfennu a'i ddull paratoi; nid yw enw'r llifyn ar ei ben ei hun yn pennu adweithydd gweithio.
Mae fioled grisial hefyd yn ymddangos mewn staenio Gram, ond nid yw hynny'n gwneud staen syml â fioled grisial yn staen Gram. Yn protocol staenio Gram ASM, mae'r canlyniad gwahaniaethol yn dibynnu ar fioled grisial, ïodin, dadliwio a gwrthstaenio yn gweithredu mewn dilyniant. Mae hepgor y camau hynny'n newid yr hyn y gall y ddelwedd ei sefydlu. Gweler staenio syml yn erbyn staenio Gram am y gwahaniaeth hwnnw.
Mae nigrosin yn cynnig ffordd wahanol o ddatgelu amlinellau: mae'n tywyllu'r cefndir tra bo'r celloedd bacteriol yn aros yn gymharol olau. Mae manylyn defnyddiol yng nghyfarwyddiadau nigrosin Merck y gall rhestr gyffredinol o amnewidion ei fethu. Mae ei fformiwleiddiad gweithio penodedig yn cynnwys fformaldehyd. Felly, ni allwch gasglu ei fod yn gydnaws â chelloedd byw o'r geiriau “staen negyddol,” er bod y celloedd eu hunain yn ymddangos heb eu staenio. Gwiriwch y fformiwleiddiad cyflawn a'r dull o baratoi'r sbesimen.
Ar gyfer sbesimenau byw, ystyriwch newid yr opteg
Os ydych am wylio celloedd yn symud neu'n rhannu, gall cyflwyno llifyn arall gymhlethu'r arsylwad. Fel yr eglura Nikon yn ei ganllaw i gyferbyniad mewn sbesimenau tryloyw, mae cyferbyniad gwedd a chyferbyniad ymyrraeth wahaniaethol, neu DIC, yn gwneud sbesimenau'n weladwy drwy wahaniaethau yn eu priodweddau optegol. Gallant ddatgelu celloedd byw heb eu staenio, ar yr amod bod gan y microsgop y cydrannau angenrheidiol.
Mae'r dewis hwn yn cadw paratoad heb staen, ond mae'n newid yr wybodaeth sydd ar gael. Gallwch ddilyn ffin neu symudiad heb wybod pa foleciwl a gynhyrchodd y cyferbyniad. Os lleoleiddio moleciwlaidd yw'r cwestiwn, dewiswch ddull labelu priodol yn lle hynny.
Ar gyfer DNA niwclear, mae cymhariaeth Invitrogen o staeniau DAPI a Hoechst yn gwahaniaethu rhwng defnydd cyffredin DAPI gyda chelloedd sefydlog a Hoechst 33342, sy'n fwy athraidd i gelloedd ac yn cael ei ffafrio ar gyfer labelu celloedd byw. Mae angen offer fflworoleuedd ar gyfer y ddau. Nid yw'r naill na'r llall yn amnewidiad uniongyrchol am staen lliw maes llachar.
Triniwch amlygiad i lifyn a goleuo fel amodau arbrofol. Cymharwch baratoadau wedi'u staenio a heb eu staenio pan mai ymddygiad y celloedd yw eich mesuriad.
Nid yw cell goch yn gell farw yn awtomatig
Mae SYTO 9 a propidium iodide yn aml yn cael eu paru i asesu cyfanrwydd pilen facteriol. Mae llawlyfr BacLight yn cysylltu pilenni cyfan â staenio gwyrdd a philenni sydd wedi'u difrodi â staenio coch. Mae angen dilysu'r dehongliad hwnnw ar gyfer y sbesimen.
Mae astudiaeth yn 2019 gan Rosenberg a chydweithwyr yn dangos y broblem. Mewn bioffilmiau E. coli 24-hour ar wydr mewn hydoddiant halwynog wedi'i glustogi â ffosffad, ymddangosodd tua 96% o'r celloedd yn bositif ar gyfer propidium iodide in situ. Eto amcangyfrifodd yr awduron fod 82% yn rhai y gellid eu meithrin ar ôl eu cynaeafu. Dangosodd delweddau confocal gelloedd ag ardaloedd mewnol gwyrdd o dan ddeunydd wedi'i staenio'n goch, gan awgrymu bod asidau niwclëig allgellog yn cyfrannu at y signal camarweiniol.
Mae'r canrannau hynny'n disgrifio mesuriadau gwahanol ar baratoadau'r astudiaeth, nid ffactor cywiro cyffredinol. Y wers ddefnyddiol yw gwirio beth a gynhyrchodd y signal. Mewn bioffilm, gall llifyn asid niwclëig ganfod deunydd y tu allan i'r celloedd yn ogystal â'r tu mewn i gelloedd sydd wedi'u difrodi. Ar gyfer casgliad ynghylch hyfywedd, mae'r ymchwilwyr yn argymell mesuriadau ategol, megis meithrin neu weithgarwch metabolig, gan gydnabod bod cyfyngiadau i bob un.
Gwiriwch beth mae'r dewis arall yn ei gynnwys mewn gwirionedd
Gall dull staenio arall gynnwys glas methylen o hyd. Mae Giemsa yn enghraifft: mae Merck yn disgrifio ei gynnyrch fel hydoddiant azure-eosin-glas methylen, sydd wedi'i fwriadu ar gyfer cymwysiadau gan gynnwys taeniadau gwaed a mêr esgyrn. Gall fod yn ddull gwahanol ar gyfer sbesimen gwahanol, ond nid yw'n bodloni gofyniad i eithrio glas methylen.
Os yw eithrio cyfansoddyn yn rhan o'r arbrawf, gwiriwch hunaniaeth a fformiwleiddiad yr adweithydd cyn cymharu delweddau. Mae'r canllaw i methyl blue, glas methylen a llifynnau ag enwau tebyg yn trafod y gwahaniaethau enwi.
Dilyswch yr amnewidiad cyn defnyddio'r canlyniad
Ar gyfer dull newydd, gwnewch gymhariaeth fach gan ddefnyddio sbesimenau cynrychioliadol a rheolydd priodol. Cadwch osodiadau y microsgop yn gymaradwy lle bo modd. Cofnodwch fformiwleiddiad yr adweithydd, paratoad y sbesimen, yr amlygiad a'r amodau delweddu fel y gellir ymchwilio i ddelwedd sy'n edrych yn well yn hytrach na'i ffafrio'n unig.
Barnwch lwyddiant yn erbyn y cwestiwn gwreiddiol. Ar gyfer morffoleg, aseswch a yw ffiniau a threfniant y celloedd yn parhau'n ddehongladwy. Ar gyfer labelu niwclear, aseswch leoliad y signal a'r cefndir. Ar gyfer hyfywedd, mynynnwch dystiolaeth y tu hwnt i wahaniad lliw deniadol. Mae'r canllaw ehangach i staenio â glas methylen a chymwysiadau labordy yn egluro sut mae'r arsylwad a'r paratoad yn cyd-fynd.
Dewiswch y dewis arall sy'n cadw'r mesuriad sydd ei angen arnoch. Dim ond un o briodweddau'r ddelwedd sy'n deillio yw lliw.