Měření mitochondriálních účinků methylenové modři: kyslík, ATP a membránový potenciál

Představme si, že laboratoř přidá methylenovou modř k mitochondriím s narušenou respirací a pozoruje nárůst spotřeby kyslíku. Nabízí se napsat, že barvivo obnovilo mitochondriální funkci. Tato věta však může být chybná. Tok kyslíku, syntéza ATP a membránový potenciál jsou tři odlišné pojmy. Sdílejí stejnou organelu podobně, jako zálohování, synchronizace a sdílení využívají stejnou cloudovou složku: souvisejí spolu, ale řídí se různými pravidly. Pokud jeden zaměníte za druhý, interpretace selže, i když jsou všechna měření technicky správná.

Methylenová modř k této záměně svádí, protože se sama účastní dějů v systému, který měří. Je to látka procházející redoxním cyklováním, která přijímá elektrony v dřívějších úsecích řetězce a předává je v pozdějších, lipofilní kation, který se hromadí v energetizovaných mitochondriích, a výrazně modrá sloučenina, která absorbuje a vyzařuje světlo ve stejných pásmech jako běžné sondy. Jediný měřený ukazatel to vše nemůže obsáhnout. Spolehlivý postup, doložený v budapešťských mitochondriálních studiích, spočívá v měření toku kyslíku spolu s rychlostí syntézy ATP, membránovým potenciálem a uvolňováním peroxidu vodíku, přičemž každý krok zahrnuje kontroly specifické pro barvivo.

Respirometrie měří tok kyslíku, nikoli energetický výstup

Respirometrie s vysokým rozlišením, ať už pomocí přístroje Oroboros Oxygraph, nebo analyzátoru extracelulárních toků Seahorse, vypovídá o jediné věci: jak rychle se kyslík redukuje. Neříká, kolik protonů bylo přečerpáno na jeden elektron, jak velká část gradientu se zachovala ani zda jej využila ATP syntáza.

Na terminologii záleží. U izolovaných mitochondrií poskytuje substrát bez ADP respiraci spojenou s únikem protonů, substrát se saturující koncentrací ADP poskytuje kapacitu oxidativní fosforylace a titrace rozpojovačem poskytuje maximální kapacitu přenosu elektronů. V intaktních buňkách jsou ekvivalenty měřené pomocí Seahorse bazální respirace, respirace spojená s tvorbou ATP citlivá na oligomycin, únik protonů, maximální respirace stanovená pomocí FCCP a nemitochondriální spotřeba kyslíku rezistentní vůči rotenonu a antimycinu. Označovat výstupy Seahorse jako stav 3 a stav 4 znamená přisuzovat jim přesnost, kterou daný preparát neumožňuje, jak jasně ukazuje metodický rámec Agilent Mito Stress Test.

Methylenová modř narušuje intuitivní spojení mezi větší spotřebou kyslíku a větší produkcí energie. Podle studie izolovaných mozkových mitochondrií zvýšilo barvivo v koncentraci 100 nM až 1 uM klidovou spotřebu kyslíku v izolovaných mitochondriích z mozku morčat při použití glutamátu s malátem, sukcinátu a alfa-glycerofosfátu jako substrátů, přičemž u alfa-glycerofosfátu činil nárůst přibližně 64 procent. Respirace stimulovaná ADP ve zdravých mitochondriích však zůstala v podstatě beze změny. Protože respirace spojená s únikem protonů vzrostla, zatímco tok stimulovaný ADP se nezměnil, vypočtený respirační kontrolní poměr klesá. Tento pokles neznamená, že barvivo mitochondrie poškodilo. Znamená, že barvivo k běžné respiraci přidalo redoxní cyklus spotřebovávající kyslík. Měření spotřeby kyslíku při použití methylenové modři, které uvádí pouze tento nárůst, zachytilo skutečnou chemickou reakci, ale neřeklo nic o uchování energie.

Experimenty zaměřené na obnovu funkce ukazují stejný rozdíl ve větším měřítku. Při zablokování komplexu I se tok kyslíku zvýšil přibližně trojnásobně, zatímco syntéza ATP jen asi 1.5násobně. K elektrodě se dostalo více kyslíku. Menší část jeho spotřeby však přispěla k tvorbě ATP. Každé tvrzení o zlepšení oxidativní fosforylace potřebuje také údaje o ATP, ideálně vyjádřené jako poměr ATP ke kyslíku s uvedením konvence použité pro jmenovatel.

Stanovení ATP měří rychlost syntézy, kterou nelze nahradit obsahem

Stanovení ATP odpovídá na jinou otázku: kolik ATP vzniká za jednotku času. Kinetické měření, ať už jde o luminiscenci světluščí luciferázy sledovanou po dobu několika minut, nebo spřažené stanovení pomocí hexokinázy a glukóza-6-fosfátdehydrogenázy odečítané při 340 nm, poskytuje rychlost. Jednorázové stanovení celkového ATP v koncovém bodě poskytuje obsah, který odráží rozdíl mezi syntézou a spotřebou a sám o sobě o oxidativní fosforylaci říká jen málo.

Budapešťská skupina použila spřaženou enzymatickou metodu s potlačenou aktivitou adenylátkinázy a zjistila, že methylenová modř v koncentraci 1 až 2 uM mírně, ale významně zvýšila tvorbu ATP v mitochondriích ošetřených rotenonem a antimycinem. Jde o skutečnou, ale částečnou obnovu funkce. Studie toxicity TEGDMA dospěla v jiném modelu k obdobnému výsledku: 5 mM dentálního monomeru TEGDMA snížilo respiraci spojenou s komplexem I z přibližně 286 na 28 jednotek toku a 2 uM barviva ji obnovilo na přibližně 86.

U barevné redoxní sloučeniny jsou nezbytné dvě kontroly. Zaprvé použijte oligomycin, abyste zjistili, jak velká část měřené syntézy ATP závisí na ATP syntáze. Zadruhé ověřte v bezbuněčném systému výtěžnost přídavku známého množství ATP s kompletní reakční směsí a přesně těmi koncentracemi barviva, které používáte, minimálně 0, 100 nM, 300 nM, 1 uM a 2 uM. Barvivo může absorbovat vyzařované světlo, inhibovat reportérový enzym nebo měnit redoxní chemii reagencií. Obecná doporučení pro luciferázová stanovení doporučují doplňkové biochemické kontrolní testy právě pro tento typ interference. Nepředpokládejte, že při 1 uM nevznikají artefakty jen proto, že zhášení bývá silnější při vyšších koncentracích.

Sondy membránového potenciálu měří distribuci barviva, nikoli tok

Safranin O, TMRM a TMRE, rhodamin 123 i JC-1 jsou kationty schopné procházet membránou. Hromadí se v záporně nabité matrix podle elektrochemické rovnováhy, takže celková fluorescence vypovídá o potenciálu nepřímo prostřednictvím toho, kde se sonda nachází. Žádná z těchto sond neměří ATP ani tok elektronů.

Každá sonda je vhodná pro určitý typ preparátu. Safranin O se hodí pro izolované mitochondrie a permeabilizované buňky, obvykle při koncentraci kolem 2 uM, s excitací kolem 495 nm a emisí kolem 585 nm. Pracuje v režimu zhášení, v němž vychytávání sondy mění celkovou fluorescenci. TMRM a TMRE jsou vhodné pro intaktní buňky při nízkém nanomolárním značení v režimu bez zhášení, kdy depolarizace uvolňuje barvivo a mitochondriální fluorescence klesá; při vysokém značení se může směr změny signálu obrátit vlivem samozhášení. JC-1 poskytuje praktický poměr zelené a červené fluorescence, ale závisí na míře značení a mitochondriální hmotě, takže je pro kvantitativní práci méně vhodný než pečlivě kontrolované měření pomocí TMRM. Tyto kompromisy shrnuje široce používaný přehled sond mitochondriálního membránového potenciálu.

Methylenová modř způsobuje optickou interferenci právě při používaných pracovních koncentracích. Její absorpční pásy kolem 600 až 665 nm se překrývají s červenou emisí sond, takže efekt vnitřního filtru, zhášení i absorpce excitačního světla jsou reálnými možnostmi. Barvivo je navíc dalším lipofilním kationtem, jehož vlastní distribuce se mění s měřeným potenciálem. Ochranou je použití více nezávislých měření a slepých vzorků: samotná sonda, samotné barvivo, sonda s každou koncentrací barviva, úplná depolarizace pomocí FCCP jako nulová reference a ideálně druhá, opticky odlišná sonda. Studie obejití komplexu III vytvořila tento precedent tím, že po inhibici antimycinem a myxothiazolem zopakovala měření obnovy membránového potenciálu pomocí safraninu O i TMRM a získala stejný kvalitativní výsledek. Jeden optický reportér je vodítko. Dva nezávislé reportéry jsou důkaz.

Tři typy preparátů, tři různé otázky

Izolované mitochondrie, permeabilizované buňky a intaktní buňky nejsou zaměnitelná nastavení citlivosti jedné metody. Jde o odlišné přístupy s různými principy fungování.

Izolované mitochondrie zachovávají elektronový transportní řetězec, vnitřní membránu a funkční aparát matrix, ale odstraňují plazmatickou membránu, cytosol a síťovou architekturu. Právě toto odstranění je cílem: substráty, ADP, inhibitory a koncentrace barviva jsou přesně definovány, takže lze určit konkrétní dráhu. Cenou je ztráta přirozeného zásobování substráty, signalizace a energetické potřeby.

Permeabilizované buňky ponechávají mitochondrie ve značné části jejich buněčné architektury, ale umožňují exogenním substrátům a ADP projít otevřenou plazmatickou membránou. Jsou vhodným nástrojem k určení poruchy konkrétní substrátové dráhy v buněčném kontextu. Nadměrná permeabilizace poškozuje vnější membránu a cytosolická regulace se vyplavuje.

Intaktní buňky zachovávají vše: bariéru plazmatické membrány, cytosolická redukční činidla, endogenní transport substrátů, mitochondriální síť a potřebu ATP. Jsou nejblíže fyziologii a nejdále od přímého objasnění mechanismu, protože vychytávání, redukce a sekvestrace barviva společně určují skutečnou expozici mitochondrií.

Studie TEGDMA záměrně použila všechny tři úrovně: izolované mozkové mitochondrie pro obnovu oxidace a potenciálu pomocí barviva, permeabilizované kmenové buňky zubní dřeně především pro lokalizaci poruchy do oxidace substrátů spojené s komplexem I a intaktní kmenové buňky pro posouzení celkového fyziologického účinku 2 uM barviva na potlačenou spotřebu kyslíku. Čtenářům, kteří porovnávají mitochondriální ukazatele napříč různými preparáty, poskytuje doprovodný výklad o tom, jak methylenová modř přenáší elektrony dýchacím řetězcem, základní informace o drahách. Průvodce čtením studií respirace s methylenovou modří vysvětluje logiku koncentrací a inhibitorů.

Kontroly, které vyžaduje redoxně aktivní barvivo

Látka procházející redoxním cyklováním vyžaduje delší seznam kontrol než běžný inhibitor, protože chemické reakce samotného barviva mohou napodobovat biologické děje.

Při respirometrii použijte komoru pouze s pufrem pro kontrolu driftu, komoru s pufrem a barvivem bez biologického materiálu, barvivo s každým extracelulárním redukčním činidlem přítomným při měření a v závěru rotenon s antimycinem pro stanovení nemitochondriální spotřeby kyslíku v intaktních buňkách. Pamatujte, že redukované barvivo se reoxiduje přenosem elektronů na kyslík za vzniku peroxidu vodíku. Slepý vzorek se samotným barvivem bez donoru elektronů proto podhodnocuje bezbuněčnou spotřebu kyslíku, která se objeví, jakmile je k dispozici NADH nebo NADPH.

Pro peroxid vodíku upřednostněte kalibrovaný Amplex UltraRed s křenovou peroxidázou před neselektivními barvivy DCFDA, ověřte výsledek katalázou a otestujte závislost na osvětlení, protože barvivo je fotosenzibilizátor. Studie mozkových mitochondrií zjistila, že zátěž peroxidem vzrostla více než čtyřnásobně již při 100 nM barviva, zatímco jeho odstraňování se zpomalilo. Peroxid přitom vznikal přímo působením redukovaného barviva bez superoxidového meziproduktu. Podrobnosti o výběru sond a kontrolách osvětlení patří do doprovodného článku o měření reaktivních forem kyslíku při experimentech s barvivy. Širší otázka, kdy peroxid působí jako signál a kdy jako zátěž, je probírána v souvislosti s buněčnou redoxní rovnováhou a tvrzeními o antioxidačních účincích.

Pro tvrzení o konkrétní dráze testujte obě inhibiční místa komplexu III: antimycin A na místě Qi a myxothiazol na místě Qo, spolu s koncovou inhibicí komplexu IV pomocí kyanidu. Dřívější studie myšího mozku uváděla obnovu respirace pomocí barviva po zablokování rotenonem, nikoli však antimycinem. Pozdější studie tří druhů naopak zjistila částečnou obnovu při použití obou inhibitorů a důkazy přímé redukce cytochromu c. Obejítí považujte za možnost slučitelnou s novějšími daty, nikoli za definitivně prokázaný mechanismus, protože koncentrace barviva, inhibiční místo, substrátové podmínky a distribuce barviva mění pozorovanou cestu přenosu elektronů.

Matice výběru metod

Pomocí této tabulky vybírejte měření podle otázky, nikoli naopak.

Minimální přesvědčivé tvrzení vyžaduje stejné koncentrace barviva, 100 nM, 300 nM, 1 uM a 2 uM, při měření toku kyslíku za podmínek únikové respirace, s ADP, s oligomycinem a s rozpojovačem, rychlosti syntézy ATP, membránového potenciálu ideálně pomocí dvou sond a kalibrovaného uvolňování peroxidu s katalázou a bezbuněčnými kontrolami. Uvádějte propojený soubor výsledků: tok kyslíku spolu s rychlostí tvorby ATP, poměrem ATP ke kyslíku, potenciálem a peroxidem. Kterékoli z těchto čísel samo o sobě je měřením, které teprve hledá svůj význam.