Proč se methylenová modř používá ke kontrastnímu dobarvení při barvení acidorezistentních bakterií

Laborant zkoumá nátěr sputa po dokončení celé sekvence barvení. Na modrém pozadí vynikají červené tyčinky a ve výsledkové zprávě se uvádí, že byly pozorovány acidorezistentní bacily. Následující den jiný preparát vykazuje rovnoměrně modré pole bez červených tyčinek a výsledek je uveden jako negativní na tuberkulózu. Jedna z těchto zpráv tvrdí více, než lze z preparátu vyvodit, a není to ta první.

Jde o nepochopení principu. Laborant považoval modré barvivo za součást detekčního mechanismu, jako by methylenová modř pomáhala najít mykobakterie. Nepomáhala. Ve chvíli, kdy se methylenová modř dostane na sklíčko, je vlastní zkouška již dokončena. Barvivo pouze obarví pozadí, aby byl výsledek čitelný. Tento článek vysvětluje úlohu methylenové modři při barvení acidorezistentních bakterií, proč se používá právě modrá a nikoli jiná barva a jaké závěry lze vyvodit z červené na modrém pozadí.

Stručná odpověď

Barvení acidorezistentních bakterií je diferenciační zkouška založená na třech principech. Karbolfuchsin, primární barvivo, se vpraví do všech buněk včetně mykobakterií s voskovitým obalem. Kyselý alkohol, odbarvovací činidlo, odstraní červené barvivo z běžných buněk, ale z acidorezistentních je extrahovat nedokáže. Methylenová modř, kontrastní barvivo, poté obarví vše, odkud odbarvovací činidlo barvivo odstranilo. Neacidorezistentní buňky, buňky hostitele a buněčná drť se tak jeví modře, zatímco acidorezistentní bacily zůstávají červené. Dobarvení zajišťuje kontrast. Nijak se nepodílí na chemickém mechanismu, díky němuž je buňka acidorezistentní.

Co dělají jednotlivé kroky

Níže uvedené schéma ukazuje rozdělení úloh. Zleva doprava znázorňuje postup a spodní pás připomíná, že každá skupina barvicích metod odpovídá na jinou otázku.

Nejprve musí barvivo proniknout do buněk. Mykobakterie odolávají běžným vodným barvivům, protože jejich obal je mimořádně hydrofobní, a proto postup průnik vynucuje. Při Ziehlově–Neelsenově metodě zahřívání do tvorby páry umožňuje karbolfuchsinu obsahujícímu fenol proniknout voskovitou stěnou. Při Kinyounově metodě za studena je teplo nahrazeno mnohem koncentrovanějším složením primárního barviva a některé modifikované varianty bez zahřívání přidávají povrchově aktivní látky. Postupy barvení acidorezistentních bakterií Americké mikrobiologické společnosti uvádějí obě složení vedle sebe a rozdíl v koncentraci je výrazný: přibližně 0.3 g bazického fuchsinu na 100 mL u metody se zahříváním oproti přibližně 4 g u metody za studena.

Druhým krokem je diferenciace. Kyselý alkohol, obvykle 3 mL koncentrované kyseliny chlorovodíkové v 97 mL 95procentního ethanolu, vymyje červené barvivo ze všech buněk, jejichž stěna neklade zvláštní odpor. Buňky s neporušeným mykobakteriálním lipidovým obalem si barvivo zachovají. Na tomto kroku stojí celá metoda a zároveň je nejcitlivější na techniku provedení, jak je rozebráno níže.

Kontrast přichází nakonec. Na sklíčku jsou nyní červené acidorezistentní buňky na téměř bezbarvém pozadí odbarvených buněk. Methylenová modř o koncentraci 0.3 procenta w/v znovu zviditelní toto pozadí barvou, která se od červené co nejvíce liší. Dobarvení je krátké, obvykle 20 až 30 sekund u metody se zahříváním a až několik minut u některých variant metody za studena. Doba závisí na konkrétním postupu, nikoli na vlastnosti samotného barviva.

Proč toto barvivo a proč modrá

Methylenová modř je kationtové bazické barvivo, což znamená, že její barevný iont nese kladný náboj a váže se na záporně nabité povrchy odbarvených bakterií, buněk hostitele a buněčné drti. Učebnice mikrobiologie OpenStax popisuje tuto interakci nábojů jako obecný princip působení bazických barviv. Methylenová modř zde však není chemicky jedinečná. Krystalová violeť a safranin jsou také bazická barviva. Volba je optická, nikoli chemická.

Červené tyčinky potřebují pozadí v kontrastním odstínu a modrá poskytuje vůči červené kontrast, který je pro mikroskopii ve světlém poli nejvhodnější. Safranin by byl nevhodným kontrastním barvivem, protože jeho výsledný růžovočervený odstín je příliš blízký zadrženému karbolfuchsinu a potlačuje právě ten rozdíl, který postup vytvořil. Krystalová violeť by vytvořila tmavě fialové pozadí, které by soupeřilo s tenkými červenými bacily o pozornost. Nejsilnějším důkazem, že jde o kontrast, nikoli o chemický mechanismus, je možnost náhrady: v některých veterinárních a modifikovaných postupech se používají zelená kontrastní barviva, například malachitová zeleň a brilantová zeleň, a zkouška stále funguje, protože jakýkoli zřetelně odlišný odstín plní stejnou úlohu.

Z toho vyplývají dva praktické důsledky. Za prvé standardní receptura nepředepisuje úpravu pH; tento prostý vodný 0.3procentní roztok nezaměňujte s alkalickými přípravky, jako je Loefflerova methylenová modř, které patří k jinému principu barvení. Za druhé příliš intenzivní dobarvení škodí. Histologická literatura výslovně upozorňuje, že příliš syté modré pozadí může zakrýt ojedinělé bacily. Ponechání barviva na sklíčku déle, než dovoluje postup, tak zhoršuje čitelnost bez jakéhokoli přínosu.

Chemie buněčné stěny, která zkoušku umožňuje

Důvod, proč kyselý alkohol buňky rozlišuje, spočívá v mykobakteriálním obalu. Jeho strukturním základem je komplex mykolyl–arabinogalaktan–peptidoglykan: peptidoglykan navázaný na arabinogalaktan, jehož vnější konce nesou mykolové kyseliny s velmi dlouhými řetězci. Ty vytvářejí vnější mykomembránu bohatou na lipidy s mimořádně nízkou propustností. Tuto strukturu podrobně popisuje přehledový článek o vnější membráně mykobakterií. Bariéra působí v obou směrech. Brání vstupu barviva, a proto průnik vyžaduje teplo nebo koncentrovanější primární barvivo. Zároveň brání extrakci barviva, a proto kyselý alkohol nedokáže karbolfuchsin odstranit, jakmile je uvnitř. Běžné bakterie tento obal nemají a barvivo ztrácejí. Acidorezistenci je tedy nejvhodnější chápat jako jev způsobený lipidovou bariérou, nikoli jako chemickou vazbu fuchsinu na mykolovou kyselinu.

Tato chemie také vysvětluje častou záhadu: mykobakterie se Gramovou metodou barví špatně a nepředvídatelně, někdy se jeví jako slabě obarvené korálkovité útvary nebo neobarvené stíny. Jejich hydrofobní stěna omezuje průnik krystalové violeti. Barvení acidorezistentních bakterií není modifikovaným Gramovým barvením. Jde o jiný diferenciační princip založený na jiné vlastnosti stěny, jak pro zbývající dvě metody ukazuje porovnání jednoduchého a Gramova barvení.

Tři metody, tři otázky

Širší skupině metod barvení bakterií jedním barvivem se věnuje atlas mikroskopického barvení.

Co červená na modrém pozadí nemůže prokázat

Červené tyčinky znamenají, že si mikroorganismy zachovaly karbolfuchsin i po působení kyselého alkoholu. Takový nález odpovídá Mycobacterium tuberculosis, ale doporučení CDC pro diagnostiku tuberkulózy výslovně uvádějí, že acidorezistentní jsou i jiné mykobakterie. Určení druhu proto vyžaduje kultivaci a vyšetření nukleových kyselin, nikoli barvu.

Chyby v technice se soustřeďují kolem obou promývacích kroků. Nedostatečné odbarvení ponechá materiál na pozadí červený a vytváří prostor pro falešně pozitivní hodnocení. Nadměrné odbarvení odstraní slabě zadržené primární barvivo a přispívá k falešně negativním výsledkům. Příliš intenzivní dobarvení skryje ojedinělé bacily v modrém pozadí. Silné nátěry, vysrážená činidla a kontaminovaná oplachová voda přidávají další artefakty.

Citlivost je omezena množstvím mikroorganismů bez ohledu na to, jak bezchybně je technika provedena. Běžná mikroskopie nátěru vyžaduje přibližně 5,000 až 10,000 bacilů na mililitr sputa a starší přehledy důkazů CDC uváděly citlivost nátěru přibližně 45 až 80 procent u kultivačně potvrzených plicních případů. Negativní nátěr tedy nikdy nevylučuje tuberkulózu. Současná doporučení CDC zachovávají kultivaci souběžně s každým nátěrem a doporučují vyšetření amplifikací nukleových kyselin alespoň u jednoho vzorku z dýchacích cest, pokud se zvažuje plicní tuberkulóza a výsledek by změnil další postup.

Praktická práce patří do rámce schválených postupů

Výukové popisy včetně tohoto článku neopravňují k práci s klinickými vzorky. Při laboratorní práci se řiďte validovaným standardním operačním postupem laboratoře, který je v souladu s aktuálními dokumenty CDC, APHL nebo CLSI; referenční dokument CDC k barvení acidorezistentních bakterií uložený v archivu Stacks ukazuje, jak takové postupy specifikují činidla a hodnocení výsledků. Práce se vzorky pro vyšetření tuberkulózy vyžaduje ochranný režim: nátěry se připravují v boxu biologické bezpečnosti, protože při přípravě vznikají aerosoly a kapénky. Doporučení CDC pro laboratorní bezpečnost uvádějí, že i tepelně fixované nátěry mohou obsahovat životaschopné tuberkulózní bacily a stále je nutné s nimi zacházet jako s kontaminovanými. Záznam v obrazové knihovně veřejného zdraví CDC o nátěru barveném karbolfuchsinem a methylenovou modří, vyšetřovaném na M. leprae užitečně připomíná, že použití metody přesahuje tuberkulózu: stejný kontrast červené na modrém pozadí slouží všude, kde se hledají acidorezistentní mikroorganismy, a pečlivě vyhodnocený negativní nález je sám o sobě výsledkem, který stojí za zaznamenání.

Hodnocení hotového preparátu

Kontrastní barvení má svůj význam při orientačním prohlížení. Mikroskopista při malém zvětšení nejprve podle modrého pozadí posoudí kvalitu nátěru: rovnoměrné rozložení buněk, neporušené buňky hostitele sloužící k zaostření a nepřítomnost výrazných sraženin. Červené podezřelé útvary pak přitahují pozornost právě proto, že nic jiného na sklíčku červené není. Potvrzení probíhá pod olejovou imerzí, kde skutečné bacily vykazují očekávaný vzhled tenkých, někdy mírně zakřivených nebo korálkovitých tyčinek, nikoli jednolitých zbytků barviva.

Obarvení pozadí také určuje formulaci výsledkové zprávy. U preparátu s červenými bacily se uvádí, že byly pozorovány acidorezistentní bacily, často se semikvantitativním stupněm podle stupnice laboratoře. U preparátu bez červených mikroorganismů se uvádí, že nebyly pozorovány acidorezistentní bacily, nikdy že je výsledek negativní na tuberkulózu. Tento rozdíl je důležitý, protože modré pole prokazuje, že barvení fungovalo, buňky přijaly kontrastní barvivo a optické podmínky byly vyhovující, ale nevypovídá nic o mikroorganismech pod mezí detekce. Modré pole bez nálezu je platným výsledkem o preparátu, nikoli verdiktem o pacientovi.

Pamatujte na rozdělení úloh a formulace výsledků bude jasná. Karbolfuchsin odhaluje podezřelé buňky. Kyselý alkohol provádí vlastní zkoušku. Methylenová modř pouze činí odpověď čitelnou: červené buňky si barvivo zachovaly i při působení kyseliny, modré je ztratily. Vše ostatní — druh, množství mikroorganismů a klinický význam — vyplývá z vyšetření přesahujících samotný preparát.