Methylenová modř jako anaerobní indikátor a indikátor kyslíku: co změna barvy prokazuje

Laborantka uzavře anaerobní nádobu, přes víko zkontroluje indikátorový proužek s methylenovou modří a uvidí to, co vidět chce. Proužek změnil barvu z modré na bílou. Zapíše, že kultivace probíhá anaerobně, a pokračuje v práci. O dva dny později na jedné plotně nic nevyroste, zatímco uzavřená zkumavka s bujónem uvnitř stejné nádoby vykazuje známky působení kyslíku. Proužek nelhal. Jen mu položila nesprávnou otázku.

Jde o záměnu pojmů. Anaerobní indikátor s methylenovou modří vypovídá o redoxních podmínkách, nikoli o sterilitě ani o validaci celého systému. Jakmile je tento rozdíl jasný, proužek se stává přesným a spolehlivým nástrojem s úzce vymezeným úkolem.

Princip: vratný redoxní pár

Rozpuštěná methylenová modř existuje ve dvou stavech. Oxidovanou formou je známý modrý kation. Redukovaná forma, označovaná jako leukomethylenová modř, je bezbarvá. Při téměř neutrálním pH lze zjednodušenou poloreakci popsat takto: jeden modrý kation plus jeden proton plus dva elektrony dávají jednu bezbarvou molekulu leukoformy. Formální potenciál se při pH 7 pohybuje kolem plus 11 milivoltů vůči standardní vodíkové elektrodě. Spadá tedy do rozsahu, kterého může dosáhnout mnoho redukčních systémů a v němž může kyslík reakci obrátit.

Redukce vyžaduje nízký lokální redoxní potenciál. Samotné odstranění kyslíku k tomu ne vždy stačí. Rané práce o anaerobióze zjistily, že methylenová modř v čisté vodě bez kyslíku zůstávala zbarvená, pokud nebyla přítomna redukující látka, a že směsi dextrózového bujónu s přibližně 0.01 procenta barviva se při 37 C snadno odbarvovaly, zatímco stejná směs uchovávaná při 4 C zůstávala modrá po celý den, jak uvádějí experimenty s čerstvou tkání a podmínkami anaerobní kultivace. Teplota, pH, glukóza, askorbát, thioglykolát a redukční aktivita mikroorganismů společně určují, zda jsou elektrony dostupné.

K opětovné oxidaci stačí kyslík. Když se k leukoformě dostane vzduch, přemění se zpět na modrou formu. Moderní navržené indikátory využívají právě tento cyklus: barvivo plus redukční činidlo plus stabilizační matrice, bezbarvá při nízkém obsahu kyslíku a po vystavení vzduchu opět modrá, jak ukazuje hybridní indikátor kyslíku s methylenovou modří založený na barvivu, redukčním činidle, povrchově aktivní látce a jílu. Tento prototyp používal 0.01 milimolární barvivo s 2.0 milimolárním askorbátem nebo glukózou při pH 11, odbarvoval se při přibližně 0.5 objemového procenta kyslíku a ve své zkušební komoře rozlišoval obsah kyslíku pod 0.1 procenta od obsahu nad 0.5 procenta.

Provozní princip je tedy jednoduchý. Modrá znamená, že zóna indikátoru je oxidovaná. Bezbarvá znamená, že zóna indikátoru dosáhla redukčních podmínek s nízkým obsahem kyslíku. Změna je vratná, lokální a chemická. Sama o sobě nic nevypovídá o mikroorganismech.

Jak funguje indikátorový proužek s methylenovou modří v anaerobní nádobě

Indikátorový proužek s methylenovou modří pro anaerobní nádobu představuje malou reakční zónu umístěnou v atmosféře nádoby tak, aby byla viditelná bez jejího otevření. Komerční provedení se liší: papírové proužky, tablety rozpouštěné nebo zvlhčované při přípravě a novější hybridní papíry. Některé vyžadují jednu kapku destilované vody k aktivaci reakční zóny. Jiné jsou indikátory v suchém provedení, které musí zůstat suché. Rozhodující je návod ke konkrétnímu výrobku, protože hydratace, umístění a doba odečtu jsou součástí chemického principu.

V praxi se zamýšlený odečet omezuje na dvě možnosti. Modrá znamená, že u proužku přetrvává kyslík nebo nedostatečně redukční podmínky. Bílá nebo bezbarvá znamená, že u proužku byly vytvořeny anaerobní redoxní podmínky. Některé komerční papíry obsahují červený podkladový pigment, takže jejich konečný redukovaný stav je růžový, nikoli bílý. Než výsledek posoudíte, zjistěte, jaký konečný stav váš výrobek slibuje.

Načasování se liší podle systému. V jedné sestavě typu GasPak začalo odbarvování přibližně během hodiny a skončilo během několika hodin, zatímco v kontrolovaném srovnání při pokojové teplotě potřebovala methylenová modř více než šest hodin. Redoxní potenciál médií v této práci dosáhl přibližně minus 100 milivoltů během 60 až 100 minut, tedy dlouho před dokončením barevné změny, a v době úplného odbarvení proužku byl výrazně pod minus 200 milivolty. Indikátor reaguje se zpožděním vůči atmosféře. Modrý proužek po první hodině neprokazuje selhání a bílý proužek po šesté hodině popisuje stav proužku v šesté hodině.

Ze stejného důvodu záleží na umístění. Proužek ponechte v plynovém prostoru nádoby, viditelný přes víko, mimo povrchy agaru a kultivační média. Vypovídá o svém bezprostředním okolí. Přitisknete-li ho ke studené stěně, zakryjete plotnami nebo necháte nasáknout kondenzátem, bude místo celé nádoby vypovídat o tomto mikroprostředí.

Co proužek ukazuje a co nikoli

Na indikátor s methylenovou modří v anaerobní nádobě pohlížejte jako na jeden senzor v jednom místě. Dokládá lokální redoxní a kyslíkové podmínky ve vlastní reakční zóně, které při dostatečném promíchání a ustavení rovnováhy obecně reprezentují plynový prostor nádoby. Cokoli nad tento rámec je odvozený závěr, který vyžaduje samostatné důkazy.

Bezbarvý proužek neprokazuje sterilitu. Sterilita znamená nepřítomnost životaschopných organismů a dokládá se validovanou sterilizací a kontrolami pro validaci kultivace. Nádoba může být zcela anaerobní a přesto kontaminovaná, nebo zcela sterilní a přesto aerobní.

Proužek nevaliduje každou část kultivačního systému. Rozpuštěný kyslík uvnitř uzavřené zkumavky, kyslík zachycený hluboko v agaru, gradienty v přeplněné nádobě i netěsnost vzniklá po odečtu jedinému proužku uniknou. Experimenty sledující prostorové rozdíly ukázaly sousedící modré a bezbarvé zóny v téže nádobě, kde se průnik kyslíku a redukční aktivita vyvažovaly odlišně. Jeden bod nemůže potvrdit stav celého objemu.

Proužek neprokazuje nepřerušenou anaerobiózu. Jediný odečet při přípravě nic nevypovídá o dvacáté hodině. Nedávné práce o kontrole kvality anaerobních podmínek upozorňují, že chemické indikátory popisují atmosféru v okamžiku odečtu a mohou vypadat vyhovující i přes nízký obsah zbytkového kyslíku. Proužek s průběhem inkubace propojuje průběžná dokumentace nebo záznamy v kontrolních bodech, nikoli jediný pohled na konečný stav.

K souvisejícímu chemickému principu barevné změny viz jak methylenová modř přechází mezi oxidovaným a redukovaným stavem. K širšímu vlivu kyslíku na manipulaci se vzorky viz kontrola kyslíku při mikroskopii a kultivaci.

Schéma, které se hodí mít vedle nádoby

Následující obrázek shrnuje článek do jedné pomůcky pro práci v laboratoři. Ukazuje tři stavy téhož proužku, oba směry reakce a hranici mezi tím, co dokládá indikátor, a validací systému.

Poruchy, které udržují proužek modrý nebo poskytují falešné ujištění

Většina poruch spadá do pěti skupin. Každá má charakteristické projevy.

Netěsná nádoba nebo vak neustále přivádí kyslík k reakční zóně. Proužek zůstává modrý nebo po odbarvení znovu zmodrá. Než začnete hledat chybu v chemii, zkontrolujte víko, těsnění, svorky a těsnicí plochy.

Vyčerpaný nebo nesprávně aktivovaný generátor plynu kyslík vůbec neodstraní. U starších systémů aktivovaných vodou byly časnými varovnými příznaky pro daný systém chybějící kondenzace přibližně po 10 až 15 minutách a absence zahřívání víka přibližně po 20 až 40 minutách. Sáček s nedostatečnou kapacitou v přeplněné nádobě selhává stejným způsobem.

Otrava katalyzátoru se týká pouze starších systémů s vodíkem a palladiem, v nichž palladium zprostředkovává reakci vodíku a kyslíku za vzniku vody. Vlhkost a sirovodík ho znehodnocují. Mnoho současných sáčků palladium vůbec nepoužívá, proto toto řešení neuplatňujte tam, kde se nehodí.

Znehodnocený nebo nesprávně použitý proužek selhává nenápadně. Barvivo a redukční činidlo při skladování ztrácejí schopnost vratné reakce. I proto byly vyvinuty hybridní formulace odolné vůči blednutí působením světla a ztrátě funkčnosti při skladování. Vyřaďte zásoby po exspiraci, zásoby s neobvyklou výchozí barvou a proužky, které byly zvlhčeny, přestože měly zůstat suché, nebo ponechány suché, přestože vyžadují zvlhčení.

Gradient nebo zpoždění klame spíše čtenáře než samotnou chemickou reakci. Nedostatečně promíchaný plynový prostor, uzavřené zkumavky s rozpuštěným kyslíkem a polotuhá média si udržují vlastní podmínky déle, než naznačuje proužek. Resazurinové proužky přecházejí přes růžovou barvu do bezbarvého stavu a často se prodávají jako rychlejší, ale jejich prahové hodnoty platí pro jejich vlastní formulaci a nelze je přenést na methylenovou modř.

Kontroly a postup odečtu, který stojí za převzetí

Dvě levné kontroly odhalí většinu chybných interpretací. Vedle probíhající kultivace ponechte čerstvý kontrolní proužek na vzduchu v místnosti. Funkční proužek s methylenovou modří tam zůstává modrý. Některé balené indikátory jsou zpočátku bledé a po otevření zmodrají, což samo o sobě slouží jako kontrola funkčnosti. Pravidelně také umisťujte čerstvý proužek do dříve validované anaerobní sestavy. Měl by dosáhnout validovaného redukovaného konečného stavu v době stanovené pro výrobek. Pokud se některá kontrola nechová správně, vyměňte šarži, než začnete odečtům v nádobě důvěřovat.

Postup odečtu vyplývá z mechanismu. Proužek umístěte do plynového prostoru tak, aby byl viditelný bez otevření nádoby, a dodržujte pokyny výrobku ke kontaktu se stěnou a zvlhčení. Zaznamenejte výchozí barvu, čas uzavření nádoby a barvu v kontrolním bodě stanoveném pro výrobek. Pokud to nádoba umožňuje, zaznamenávejte v určených kontrolních bodech během inkubace, že indikátor zůstává redukovaný. Konečnou barvu zaznamenejte bezprostředně před otevřením. Tato barva před otevřením je konečným výsledkem dané kultivace. Po otevření očekávejte opětovné zmodrání a nenechte je přepsat předchozí záznam.

Pokud proužek zůstává modrý i po uplynutí stanovené doby, považujte anaerobiózu za neověřenou. Kontrolujte postupně celý řetězec: těsnění, sáček, případný katalyzátor, hydrataci a exspiraci indikátoru a nakonec funkčnost indikátoru ve srovnání s kontrolou na vzduchu. Růst nebo nepřítomnost růstu interpretujte až po ověření atmosféry, s využitím anaerobní kultivační sestavy a kontrolních organismů odpovídajících danému použití.

V oblasti, pro kterou je určen, si proužek zaslouží poslední slovo. Ať je modrý, nebo bezbarvý, odpovídá na jednu otázku o jednom místě v jednom okamžiku. Položíte-li mu tuto otázku ve stanoveném čase a se souběžnými kontrolami, odpoví spolehlivě. Ptáte-li se na sterilitu, na každou zkumavku nebo na celou inkubaci na základě jediného pohledu, žádný chemický princip indikátoru takový odečet nezachrání.