Methylenová modř a neurotransmitery: serotonin, dopamin, GABA a acetylcholin

O methylenové modři se často říká, že zvyšuje serotonin, zvyšuje dopamin, zklidňuje GABA a zostřuje působení acetylcholinu, a to vše najednou. Tato věta slučuje čtyři samostatná laboratorní zjištění do jediného účinku v lidském těle. Studie, o které se opírá, měřily různé cíle v různých preparátech při koncentracích, které se liší zhruba tisícinásobně. Když jednotlivé cíle oddělíte, obraz je zajímavější, ale zároveň vyžaduje větší opatrnost, než tato jediná věta připouští.

Základní myšlenka je jednoduchá. Molekula, která se ve zkumavce váže na enzym, udělala jednu věc: navázala se ve zkumavce na enzym. Zda to změní hladinu neurotransmiteru v živém mozku, závisí na koncentraci, která se dostane do tkáně, na chemické formě molekuly při jejím příchodu a na všem ostatním, co tato molekula při stejné koncentraci dělá. Každý oddíl níže ponechává tyto tři otázky u zjištění, ke kterému patří.

Serotonin: dva cíle, dvě koncentrace

Ze čtyř systémů má serotonin nejsilnější důkazní základ, který vychází ze dvou odlišných molekulárních cílů. Ty by se neměly slučovat.

Prvním cílem je monoaminooxidáza typu A, mitochondriální enzym, který odbourává serotonin. Methylenová modř inhibuje purifikovanou lidskou MAO-A jako inhibitor s těsnou vazbou s Ki kolem 27 nanomolárních, zatímco k ovlivnění MAO-B jsou zapotřebí mnohem vyšší koncentrace, jak ukázala kinetická studie, která spojila toto barvivo se serotoninovou toxicitou. Související výzkum zjistil stejnou selektivitu v tkáni potkaní epifýzy, kde blokáda MAO-A zvýšila množství indolů odvozených od serotoninu, snížila hladinu metabolitu serotoninu 5-HIAA a změnila napřimovací reflex u žab spojený se serotoninem, jak uvádí studie redoxních barviv a indolů v epifýze. Dva různé preparáty, stejný směr: méně odbourávání, více zachovaného serotoninu tam, kde by jej enzym odstranil.

Druhým cílem je samotný serotoninový transportér. V buňkách exprimujících lidský transportér methylenová modř snižovala vychytávání fluorescenčního substrátu i značeného serotoninu s IC50 kolem 1.4 mikromolárních a potlačovala proudy vyvolané serotoninem při měření metodou patch-clamp, podle přímé charakterizace methylenové modři na SERT. Autoři prověřili zjevná alternativní vysvětlení a zjistili, že účinek nezávisel na signalizaci cGMP, změnách vápníku ani expresi transportéru na povrchu buněk.

Všimněte si rozdílu mezi oběma čísly. Inhibice MAO-A probíhá v nanomolárním rozmezí. Inhibice transportéru vyžaduje zhruba padesátkrát více barviva. Nízká expozice, která plně ovlivňuje enzym, může na transportér působit jen nepatrně. Kdo tyto výsledky spojuje do jediného tvrzení o serotoninu, zprůměrovává dvě různá dávková rozmezí do jednoho.

Zda má některý z těchto cílů význam u člověka užívajícího jiné serotonergní léky, je otázka týkající se medikace a patří do průvodce lékovými interakcemi. Tento článek mapuje cíle; klinická doporučení obsahuje zmíněná stránka.

Dopamin: nejslabší přímé důkazy

U dopaminu vyžaduje poctivost největší zdrženlivost. Neexistuje dobře doložená studie, která by ukazovala, že methylenová modř blokuje dopaminový transportér nebo se přímo váže na dopaminové receptory. Často citovaná hodnota IC50 transportéru 1.4 mikromolárních patří serotoninovému transportéru, nikoli DAT, a nikdy by se neměla přiřazovat jinému cíli.

Dostupné důkazy jsou místo toho nepřímé. Protože enzymy MAO metabolizují také dopamin, inhibice MAO zachovává dopamin spolu se serotoninem a noradrenalinem. V mitochondriálních preparátech methylenová modř blokovala přeměnu neurotoxinu MPTP zprostředkovanou MAO-B na jeho dopaminergní toxický produkt s potencí srovnatelnou s deprenylem, lékem na Parkinsonovu nemoc, jak popisuje studie bioaktivace MPTP a související práce o MAO-B. Výzkum na zvířatech přidává dílčí poznatky: přibližně trojnásobný nárůst bazálního uvolňování dopaminu z řezů potkaního striata při 10 mikromolárních, zkoumaný v kontextu signalizace oxidu dusnatého, nikoli jako blokáda transportéru, a nejednotné výsledky v jednotlivých oblastech po systémovém podání, přičemž některé studie zjistily nárůst serotoninu a noradrenalinu, zatímco dopamin se téměř nezměnil.

Poznatky o dopaminu jsou tedy skutečné, ale nepřímé. Vedou přes enzym, který zpracovává několik monoaminů současně, nikoli přes cíl specifický pro dopamin. Jakékoli tvrzení, že methylenová modř zvyšuje dopamin u lidí, přeskakuje krok, v němž by to bylo skutečně prokázáno.

GABA: blokování brzdy ve vazebné kapse

Zjištění týkající se GABA je přesné a odporuje pověsti tohoto barviva. V buňkách exprimujících lidské receptory GABA-A methylenová modř inhibovala proudy vyvolané GABA již přibližně od 3 mikromolárních, s IC50 kolem 31 mikromolárních pro běžnou konfiguraci alpha1-beta2-gamma2, jak ukázala elektrofyziologická studie, která zmapovala místo působení.

Cennou částí je právě zmapování místa působení. Mutace v pikrotoxinovém místě ponechaly inhibici beze změny a benzodiazepinová a zinková místa byla vyloučena porovnáním podjednotek. Naproti tomu mutace dvou reziduí, o nichž je známo, že tvoří samotnou vazebnou kapsu pro GABA, blokádu výrazně oslabily. To ukazuje na kompetitivní antagonismus v místě pro agonistu, nikoli na alosterickou modulaci jinde. Účinek přetrvával u synaptických i extrasynaptických kombinací podjednotek a po vymytí rychle odezněl.

Vzniká tím skutečný rozpor, který stojí za to jasně pojmenovat. Molekula zkoumaná pro podporu paměti zároveň v laboratorní misce potlačuje rychlý inhibiční přenos. Zda k tomuto potlačení dochází v živém mozku, závisí na místní koncentraci, a 31 mikromolárních je ve srovnání s většinou systémových expozic vysoká hodnota, jak rozebírá závěrečný oddíl. Samotný rozpor je zde zjištěním; jeho vyřešení by vyžadovalo experimenty, které dosud nikdo neprovedl.

Acetylcholin: dva protichůdné zásahy

U acetylcholinu existují dvě zjištění, která působí opačnými směry. Právě proto je nutné uvádět je odděleně.

Na jedné straně methylenová modř inhibuje enzymy, které odstraňují acetylcholin. Acetylcholinesteráza v červených krvinkách skotu byla kompetitivně inhibována přibližně při 0.57 mikromolárních, bovinní enzym kolem 0.42 mikromolárních a esterázová aktivita lidské plazmy kolem 1.1 mikromolárních, přičemž butyrylcholinesteráza byla inhibována přibližně v rozmezí 0.4 až 5.3 mikromolárních podle druhu a preparátu, jak shrnuje přehled působení methylenové modři v nervovém systému. Zpomalení odstraňování ponechává v synapsi více neurotransmiteru, což je stejný princip jako u několika schválených léků na Alzheimerovu nemoc.

Tato chemie má ale jednu podmínku. Oxidovaná modrá forma enzym inhibuje; redukovaná bezbarvá forma nikoli. Dlouhé inkubace, při nichž se barvivo může redukovat, proto samy o sobě vedou k naměření slabší inhibice. Každý číselný výsledek testu cholinesterázy má jednu neviditelnou proměnnou: kolik barviva bylo při měření stále modrého.

Na druhé straně methylenová modř blokuje nikotinový receptor alpha7, jeden z receptorů, na které acetylcholin působí. Lidské receptory alpha7 exprimované v žabích oocytech byly inhibovány s IC50 kolem 3.4 mikromolárních prostřednictvím nekompetitivního, na napětí nezávislého antagonismu, který ponechal potenci agonisty beze změny, a 3 mikromolární koncentrace zcela potlačila synaptické odpovědi vyvolané cholinem v řezech potkaního hipokampu, jak uvádí studie receptoru alpha7. Při podobných nízkých mikromolárních koncentracích tedy barvivo zároveň zachovává neurotransmiter a tlumí jeden z jeho receptorů. Celkový účinek na cholinergní signalizaci nelze vyvodit z žádného z těchto zjištění samostatně. Tato nejednoznačnost souvisí s širší literaturou o Alzheimerově nemoci i se související diskusí o výzkumu kognice a nemocí, aniž by zde byla vyřešena.

Srovnání na jednom místě

Nejcitlivější a nejméně citlivý cíl od sebe dělí tři řády. Toto rozpětí shrnuje celý článek v jediné tabulce.

Dosahují tyto koncentrace mozku?

Číslo ze zkumavky nemá význam, pokud vedle něj nestojí údaj o expozici. Po intravenózním bolusu přibližně 1.4 mg na kg byly hlášeny průměrné hladiny v lidské plazmě kolem 5 mikromolárních, zatímco perorální dávka 100 mg vedla podle stejného okruhu literatury k hladinám v plné krvi kolem 0.08 mikromolárních. Studie distribuce u potkanů nacházejí hladiny v mozku přibližně desetkrát až dvacetkrát vyšší než hladiny v oběhu. Jde však o celkové barvivo v homogenizované tkáni, nikoli o volné oxidované barvivo v synapsi, a vazba na plazmatické bílkoviny kolem 94 procent spolu s distribucí do krevních buněk dále snižuje volnou frakci.

Při porovnání s tabulkou nejde o jednoduché ano či ne, ale o odstupňovaný obraz. Inhibice MAO-A nastává hluboko pod typickými intravenózními expozicemi a je farmakologicky věrohodná při podání barviva touto cestou. Účinky na cholinesterázu a alpha7 leží v nízkém mikromolárním pásmu, do kterého zasahují intravenózní vrcholy, ale běžné perorální dávky jej nemusí dosáhnout. IC50 pro GABA-A ve výši 31 mikromolárních leží nad většinou věrohodných systémových expozic, takže tuto konkrétní blokádu je nejobtížnější předpokládat u člověka jako celku. Každý řádek tohoto srovnání vyžaduje stejnou výhradu: rozhodující je koncentrace volného, oxidovaného, extracelulárního barviva u daného cíle, tedy veličina, kterou žádný odběr krve přímo neměří.

Co z toho nevyvozovat

Žádný řádek tabulky neprokazuje, že methylenová modř u člověka předvídatelně zvyšuje nebo snižuje hladinu některého neurotransmiteru. Inhibice enzymu v purifikovaném preparátu, blokáda transportéru v buněčné linii a antagonismus receptoru v tkáňovém řezu jsou vždy jedním kontrolovaným krokem oddělené od synaptické reality. Oddíl o cholinergním systému navíc ukazuje, jak dvě pravdivá zjištění ve výsledku ponechávají nejistotu. Odpovědným využitím této stránky je chápat ji jako mapu cílů, na které molekula prokazatelně působí, s uvedenou silou tohoto působení, aby diskuse o mechanismech zůstala ukotvena v tom, co bylo skutečně naměřeno. Otázku, jak tyto zásahy souvisejí s předepsanými léky, rozebírá průvodce interakcemi, spolu s dalším kontextem v základech farmakologie a doprovodném vysvětlení mechanismů.