Methylenová modř a expozice světlu: vlnová délka, ozářenost a geometrie ošetření

Dvě publikace uvádějí, že methylenovou modř vystavily světlu o dávce 10 J na čtvereční cm. V jedné dojde k usmrcení bakterií. V druhé nenastane nic měřitelného. Čtenář, který porovnává pouze dávku, usoudí, že výsledky v tomto oboru jsou nekonzistentní. Obor je konzistentní. Dávka nikdy nepopisovala celou expozici.

Expozice světlu je malý systém parametrů, které působí společně: vlnová délka, ozářenost, doba trvání, výsledná fluence, dostupnost kyslíku, koncentrace a stav agregace barviva, časový odstup mezi podáním barviva a ozářením a optická dráha, kterou světlo skutečně prochází vzorkem. Změna jediného parametru mění fotochemii. Tento článek postupně rozebírá jednotlivé parametry a poté odlišuje fotobiomodulaci blízkým infračerveným světlem od přímé fotoaktivace barviva, protože právě tyto dva režimy se zaměňují nejčastěji.

Vlnová délka rozhoduje, zda se barvivo zapojí

Methylenová modř ve vodě jako monomer silně absorbuje červené světlo, s maximem přibližně při 664 až 665 nm a ramenem absorpčního pásu na kratších vlnových délkách kolem 610 nm, které roste s agregací barviva do dimerů a větších uspořádaných shluků. Molární extinkční koeficient poblíž maxima je řádově 65,000 až 85,000 M-1 cm-1, takže už mikromolární roztoky jsou intenzivně modré. Dřívější přehled fotochemie methylenové modři s DNA a biologickými substráty popisuje toto absorpční chování i následnou chemii excitovaných stavů: absorpce vede ke krátce žijícímu singletovému stavu, z něhož dochází k přechodu do déle žijícího tripletového stavu s uváděnými výtěžky kolem 0.5. V provzdušněném roztoku je tento stav zhášен kyslíkem přibližně během 2 mikrosekund.

Právě při tomto zhášení se dvě fotochemické dráhy rozcházejí. V chemii typu II předává barvivo v tripletovém stavu energii kyslíku v základním stavu a vytváří singletový kyslík, s běžně uváděnými výtěžky kolem 0.52. V chemii typu I triplet místo toho předává substrátu elektron nebo vodík a vytváří radikály včetně superoxidu a hydroxylových radikálů. Obě dráhy mohou probíhat současně a konvenční fotodynamický účinek zůstává výrazně závislý na kyslíku i tehdy, když přispívá také typ I.

Pro výběr vlnové délky pro methylenovou modř z toho plyne jednoduché pravidlo. Červené světlo přibližně od 630 do 680 nm se překrývá s absorpčním pásem barviva, přičemž 660 až 665 nm leží poblíž maxima monomeru. Může tedy spouštět fotochemické reakce fotosenzibilizátoru všude, kde je přítomno nezanedbatelné množství barviva. Blízké infračervené světlo při 810 nm leží daleko mimo absorpční pás základního stavu, a proto je pro přímou excitaci barviva málo vhodné. Koncentrace situaci komplikuje jedním podstatným způsobem: s jejím růstem přibývá barviva v dimerních a agregovaných formách, které absorbují blíže k 610 nm a na jednu molekulu fotosenzibilizují méně účinně. Zdvojnásobení množství barviva tedy nezdvojnásobí účinek. Související přehled methylenové modři a terapie červeným světlem chápe toto pravidlo absorpce jako předpoklad jakékoli fotosenzibilizované reakce.

Ozářenost, doba trvání a fluence jsou tři parametry, nikoli jeden

Fluence v J na čtvereční cm je ozářenost vynásobená časem. Samotný údaj o fluenci skrývá rychlost, s jakou energie dopadala, a na této rychlosti záleží.

Vysoká ozářenost po krátkou dobu a nízká ozářenost po dlouhou dobu mohou dát stejnou fluenci, ale odlišnou chemii. Vysoká ozářenost spotřebovává rozpuštěný kyslík rychleji, než ho difuze doplňuje, což v průběhu expozice omezuje dráhu typu II závislou na kyslíku. Zároveň přivádí teplo a tkáň na zahřívání reaguje změnami průtoku krve, které ovlivňují okysličení i distribuci barviva. Nízká ozářenost při dlouhé expozici umožňuje průběžné zásobování kyslíkem, ale současně dává čas opravným procesům a reoxygenaci, aby působily během samotné expozice. Učebnice fotochemie označují předpoklad, že záleží pouze na celkové dávce, jako reciprocitu. Ta selhává, kdykoli se zapojuje kyslík, zahřívání nebo biologické procesy, což ve tkáni znamená téměř vždy.

Antimikrobiální fotodynamické expozice s methylenovou modří u lidí běžně používají 6 až 18 J na čtvereční cm, což se překrývá s hodnotami pro fotobiomodulaci. Samotná fluence proto nemůže určit režim. Expozice 10 J na čtvereční cm při 660 nm ve tkáni obsahující barvivo představuje fotochemii řízenou fotosenzibilizátorem. Stejná fluence při 810 nm ve tkáni se stopovým množstvím barviva je něco zcela jiného. Číslo se shoduje. Princip se liší.

Optická dráha a geometrie vzorku rozhodují, s čím se světlo setká

Podle Beerova–Lambertova zákona je přední část vzorku vystavena mnohem většímu množství světla než zadní. V kyvetě s barvivem o koncentraci desítek mikromolů může první milimetr absorbovat většinu dopadajícího červeného světla, takže hlubší vrstvy zůstanou prakticky neozářené. Pokud stejný roztok umístíte v malém objemu do mělké jamky, expozice bude téměř rovnoměrná. Stejné barvivo, stejná lampa, stejná fluence na povrchu, jiný výsledek.

Ve tkáni se k absorpci přidává rozptyl. Červené světlo kolem 660 nm proniká řádově do milimetrů, přičemž přesnou hloubku určuje obsah krve, pigmentace a typ tkáně. Jamky přidávají vlastní artefakty: čočkový efekt menisku, odrazy od stěn, zastínění okrajových jamek a zahřívání malých objemů pod zdrojem. Dvě laboratoře, které uvádějí totožné nastavení lampy, ale používají jiné typy destiček, objemy nebo vzdálenosti zdroje, provedly různé experimenty.

Vzdálenost si zaslouží zvláštní pozornost, protože jde o nejčastější skrytou proměnnou. Ozářenost se se vzdáleností od nekolimovaného zdroje rychle snižuje. Posunutí lampy z 2 cm na 5 cm nad destičkou tak může ozářenost snížit několikanásobně, zatímco popis v metodické části zůstane stejný. Bez změřené ozářenosti na povrchu vzorku jsou publikované fluence vypočtené z výkonu udávaného výrobcem odhady, nikoli měření.

Komentovaný průvodce parametry: co činí expozici reprodukovatelnou

Původním materiálem vytvořeným pro tuto stránku je kontrolní seznam. Expozici světlu ve studii, která tyto údaje neuvádí, nelze porovnávat s jinou, jakkoli podobně vypadá hlavní údaj o dávce.

1. Vlnová délka a šířka pásma. Maximum a celková šířka, nikoli název barvy. Červené LED pokrývají 630 až 680 nm, kde se absorpce barviva výrazně liší.
2. Změřená ozářenost na povrchu vzorku v mW na čtvereční cm. Výkon ve wattech udávaný výrobcem není ozářenost.
3. Doba trvání a pulzování. Kontinuální versus pulzní osvětlení, včetně frekvence pulzů a střídy, pokud jsou relevantní.
4. Fluence vypočtená z výše uvedené dvojice změřených údajů v J na čtvereční cm.
5. Koncentrace, formulace a stav agregace barviva. Monomer poblíž 664 nm fotosenzibilizuje jinak než agregáty poblíž 610 nm.
6. Interval mezi podáním barviva a ozářením. Minuty až hodiny mezi podáním barviva a ozářením určují, kde se barvivo nachází, když dopadne světlo.
7. Okysličení. Provzdušněný roztok oproti hypoxické tkáni přímo mění poměr mezi typem I a typem II.
8. Geometrie. Hloubka vzorku, objem, typ nádoby, vzdálenost a úhel zdroje a hloubka cílové oblasti ve tkáni.

Užitečný návyk při čtení publikací: nejprve zkontrolujte interval mezi podáním barviva a ozářením. Prozradí záměr. Fotodynamické experimenty záměrně ozařují tkáň obsahující barvivo. Kombinované experimenty mohou oba zásahy záměrně časově oddělit, jak ukazují příklady níže.

Fotobiomodulace blízkým infračerveným světlem není fotoaktivace barviva

Fotobiomodulace, obvykle označovaná zkratkou PBM, využívá červené nebo blízké infračervené světlo k modulaci endogenní signalizace bez přidání fotosenzibilizátoru. Fotodynamická terapie, obvykle označovaná zkratkou PDT, používá společně tři složky: světlo, které fotosenzibilizátor absorbuje, samotný fotosenzibilizátor a kyslík. Jejich působením vzniká nárazově množství reaktivních částic, které poškozují cíl. Přehled mitochondrií jako cíle neuroprotekce spojuje methylenovou modř s PBM, protože obě zasahují buněčné dýchání z různých stran: barvivo působí jako katalytický redoxní přenašeč podporující tok elektronů, zatímco u PBM se předpokládá, že podporuje disociaci inhibičního oxidu dusnatého z cytochrom c oxidázy v komplexu IV. Tento enzymový mechanismus musí zůstat označen jako hypotéza.

Dvě nejcitovanější kombinované studie na myších používají světlo při 810 nm, a právě proto nedokládají fotoaktivaci barviva. Ve studii předběžného ošetření před spánkovou deprivací dostávaly myši před deprivací denně methylenovou modř v dávce 0.5 mg na kg, pulzní laser při 810 nm každý druhý den, nebo obojí. Kombinované předběžné ošetření chránilo paměťové chování a synaptické proteiny v hipokampu, zatímco jednotlivé zásahy většinou selhávaly. Ve studii chronického stresu se souběžným ošetřením dostávaly myši PBM při 810 nm a 8 J na čtvereční cm spolu s každodenním podáváním barviva v dávce 0.5 mg na kg. Laser byl aplikován jako první a barvivo bylo injekčně podáno o dvě hodiny později, výslovně proto, aby se zabránilo ozáření tkáně obsahující barvivo. Všechny tři skupiny zvrátily poruchy učení, přičemž aditivní přínos se projevil hlavně u sérového kortizolu a reaktivních forem kyslíku v mozku. Tyto výsledky zkoumají dva mitochondriální zásahy použité společně. Sbírka fotodynamických studií toto rozlišení zachovává tím, že u každé indikace zaznamenává vlnovou délku.

Důkazy týkající se kůže patří na druhou stranu tohoto rozlišení. Údaje o použití methylenové modři se světlem na kůži u lidí se soustřeďují na 630 až 680 nm, s lokálně nebo intralezionálně podávaným barvivem a se záměrem destrukce či remodelace, což je z definice PDT. Uvádět toto odstranění cílových změn jako důkaz, že barvivo posiluje PBM, nebo uvádět záchranný účinek při 810 nm u myší jako důkaz, že panel při 660 nm společně s barvivem představuje protokol pro kognitivní funkce, znamená zaměňovat tyto režimy. Referenční přehled dávkování a farmakologie a průvodce bezpečností a interakcemi dále rozvádějí části tohoto tématu týkající se koncentrace a kontraindikací.

Než začnete porovnávat čísla, pojmenujte princip. Vlnová délka určuje, zda barvivo absorbuje. Ozářenost a doba trvání určují, co s touto absorpcí udělá chemie. Geometrie určuje, která část vzorku je tomu vůbec vystavena. Dvě expozice, které se shodují v jednom parametru a v ostatních se liší, představují různé experimenty. Považovat je za zaměnitelné je chyba, které má tento průvodce zabránit. Z ničeho z toho nevyplývá domácí protokol; světlo o vlnové délce odpovídající absorpci barviva spolu se systémově podaným barvivem mění jinak modulační expozici na fotochemii řízenou fotosenzibilizátorem, která patří do rukou klinických odborníků.