Loefflerova alkalická a polychromní methylenová modř: vysvětlení barvení

Na laboratorním stole určeném k barvení mohou vedle sebe stát tři lahvičky, každá označená jako některá varianta methylenové modři. Na jedné stojí vodná methylenová modř 1%. Na druhé Loefflerova alkalická methylenová modř. Na třetí polychromní methylenová modř. Zaneprázdněný pracovník sáhne po té, která je nejblíž. Nátěr se pak obarví příliš slabě, příliš jednotně modře nebo nečekanými odstíny fialové a vina za výsledek se přičítá vzorku.

Jde o problém složení barvicího roztoku, nikoli vzorku. Tyto tři roztoky obsahují příbuzná barviva, ale představují různé přístupy k barvení. Jeden je prosté kationtové barvivo při téměř neutrálním pH. Druhý je stejné barvivo, jehož účinek zesiluje zásada. Třetí už vůbec není jediné barvivo, ale záměrně oxidovaná směs. Použijete-li nesprávný roztok, změníte tím samotný princip barvení.

Stručná odpověď

Prostá vodná methylenová modř je výchozím bodem: přibližně 1% barviva ve vodě, jednoduché kationtové barvivo pro zobrazení morfologie bakterií a obecnou mikroskopii. Loefflerova alkalická methylenová modř obsahuje malé odměřené množství zředěné zásady přidané k alkoholovému zásobnímu roztoku naředěnému vodou. Tím se zvyšuje pH a zesiluje vazba kationtového barviva na kyselé struktury bakterií. Polychromní methylenová modř je methylenová modř záměrně vyzrálá oxidací v zásaditém prostředí, takže lahvička obsahuje vedle zbytkové methylenové modři také směs demethylovaných homologů (azure A, azure B, azure C), thioninu a methylenové violeti. Tato směs barví různé struktury různými odstíny.

Pokud si máte zapamatovat jedinou větu: alkalizace mění intenzitu barvení, zatímco polychromování mění jeho barvy.

Běžná vodná methylenová modř: referenční bod

Nejjednodušší přípravek tvoří methylenová modř rozpuštěná ve vodě, běžně v koncentraci 1% w/v, bez zásady a bez oxidace. Barevnou složkou je methylthioniniový kation s chloridovým protiiontem, malé ploché fenothiazinové barvivo popsané v záznamu o methylenové modři v databázi PubChem jako methylthioniniumchlorid. Jako kation se váže na fosfátovou kostru nukleových kyselin a kyselé skupiny bakteriálních buněčných stěn, čímž barví buňky modře na světlém pozadí.

Jeho předností je předvídatelnost. Jádra a bakterie se zobrazují modře. Kontrast je mírný. Hůře viditelné mikroorganismy se mohou obarvit slabě, což je přesně omezení, které se Loeffler snažil odstranit. Širší skupinu jednoduchých bakteriálních barvení, do níž tento roztok patří, popisuje přehled jednoduchého barvení bakterií. I zde je důležité přesně rozlišovat identitu barviva: methylová modř je zcela jiná molekula, jak vysvětluje článek methylová modř versus methylenová modř. Vyhledávání v katalogu pouze podle názvu barvy tak může vést k objednání nesprávné skupiny barviv.

Loefflerova alkalická methylenová modř: stejné barvivo, silnější účinek

Klasický Loefflerův recept kombinuje alkoholový zásobní roztok methylenové modři se zředěnou zásadou ve vodě. Učebnicové varianty uvádějí 0.3 g barviva ve 30 mL 95% ethanolu a 100 mL 0.01% vodného roztoku hydroxidu draselného (nebo ekvivalentně 30 mL nasyceného alkoholového roztoku methylenové modři, 100 mL destilované vody a 1 mL 1% KOH). Výsledkem je pracovní roztok s přibližně 0.3% barviva při výrazně zásaditém pH. Komerční přípravky vycházejí ze stejného principu a katalog mikrobiologických barviv Thermo Fisher uvádí Loefflerovu alkalickou methylenovou modř vedle polychromní a vodné varianty jako samostatné katalogové položky s odlišným určením.

Klíčem je zásada. Zvýšení pH deprotonuje karboxylové a fosfátové skupiny ve vzorku a zvyšuje hustotu záporně nabitých míst. Alkoholový zásobní roztok přitom udržuje barvivo plně rozpuštěné, takže k těmto místům přichází v monomerní formě. Výsledkem je rychlejší a intenzivnější barvení bakterií než při použití neutrálního vodného barviva, s typickými sytě modrými tyčinkami a koky běžného bakteriologického nátěru. Barvení obvykle trvá jednu až tři minuty a následuje oplach vodou.

Klasickým použitím je Corynebacterium diphtheriae kultivované na Loefflerově sérové půdě: štíhlé, často kyjovité tyčinky s výrazně obarvenými metachromatickými Babesovými-Ernstovými granuly zásobního polyfosfátu. Spojení půdy a barviva je historické, obojí se připisuje témuž bakteriologovi a diagnostickým přínosem je kontrast granul. Kromě práce s difterií slouží barvivo jako obecné bakteriologické barvivo pro nátěry z kultur, k zobrazení morfologie bakterií rodu Neisseria v klinických nátěrech a všude tam, kde není nutné Gramovo barvení, ale prostá vodná modř barví příliš slabě. Jde o monochromní barvivo. Všechny kyselé struktury získají některý odstín modré. Pokud protokol vyžaduje barevné rozlišení, samotná zásada ho nezajistí.

Jedno praktické upozornění: zásadité roztoky barviv se při skladování a pohlcování oxidu uhličitého znehodnocují a tvoří sraženiny. Laboratoře proto buď připravují menší objemy, nebo kupují katalogový roztok a dodržují jeho dobu použitelnosti, místo aby dál používaly starou lahvičku, která už na každém sklíčku zanechává usazeniny.

Polychromní methylenová modř: jeden název, několik barviv

Polychromní methylenová modř vychází ze stejného barviva, ale podrobuje ho řízené oxidaci v zásaditém prostředí, historicky označované jako zrání nebo polychromování. Stárnutí v zásaditém prostředí, zahřívání s uhličitanem nebo oxidace činidly, jako je dichroman, postupně odštěpuje methylové skupiny z dimethylaminových substituentů. Produktem je směs: zbytková methylenová modř a dále azure B (ztráta jedné methylové skupiny), azure A a azure C (další demethylace), thionin (zcela demethylovaný) a vedlejší oxidační produkty ze skupiny methylenové violeti. Každá složka má vlastní odstín a afinitu ke tkáním, takže směs barví metachromaticky: jádra, granula, muciny a chrupavka získávají odlišné tóny od modré po červenofialovou.

Stejná chemie stojí za známými barveními krve. První výzkumníci zjistili, že alkalizovaná methylenová modř barví jádra parazitů malárie odstíny fialové, ale jejich vodné vyzrálé roztoky byly nestabilní a během několika dnů tvořily sraženiny. Přehled o tom, jak vzniklo purpurové barvení krve, popisuje, jak Malachowski a Romanowsky v roce 1891 nezávisle využili tohoto účinku, jak byl zaveden methanol ke stabilizaci sraženiny barviva a k fixaci nátěrů bez zahřívání a jak Giemsa později standardizoval směs na základě odměřeného množství azure B a eosinu se stabilizací glycerolem. Moderní barviva Giemsova typu přímo vycházejí z polychromní methylenové modři s eosinem, kombinace vytvářející Romanowského efekt. Podrobnosti o spojení s eosinem a složce azure B najdete v článku barviva Romanowského typu a interakce azure B s eosinem.

Protože jde o směs, je polychromní methylenová modř ze své podstaty nejméně standardizovanou z těchto tří variant. Přesné zastoupení odstínů závisí na způsobu a rozsahu oxidace. Dodavatelé pro histologii ji proto prodávají jako samostatný produkt s vlastním testováním barvicích vlastností, nikoli jako zestárlý Loefflerův roztok. Mezi typická použití patří metachromatické znázornění granul žírných buněk, mucinů a chrupavky, zobrazení detailů plazmatických buněk a Helicobacter pylori ve tkáňových řezech polychromními metodami Goodpastureova typu. Je správnou volbou, když jde o rozlišení pomocí barev, a nesprávnou volbou, když protokol očekává čistý monochromní obrys bakterií.

Porovnání složení a účelu

Tabulku chápejte jako postup pro rozhodování. Pokud se vzorek barví příliš slabě, změňte přístup k pH a sáhněte po Loefflerově roztoku. Pokud se obarví vše, ale nic se barevně neodlišuje, změňte přístup k barvivu a sáhněte po polychromní variantě. Pokud nátěr obarvený Loefflerovým roztokem krásně ukazuje granula, ale vedoucí se ptá, proč mají jádra a cytoplazma stejnou modrou barvu, odpověď zní, že žádné zásadité monochromní barvivo toto rozlišení nedokáže. Takový úkol patří polychromní skupině a jejím odvozeným barvivům pro krev.

Jak se vyhnout běžným záměnám

Většinu nejasností způsobují dvě chyby. První je považovat Loefflerův roztok za zaměnitelný s prostou methylenovou modří, protože oba v lahvičce vypadají modře. Liší se pH a intenzitou, a pokud tam, kde je předepsán Loefflerův roztok, použijete neutrální barvivo, ztratíte právě ten kontrast granul, na němž je protokol založen. Druhou chybou je považovat jakoukoli starou nebo náhodně zestárlou zásaditou modř za polychromní. Nekontrolované stárnutí vytváří neznámou směs o neznámé koncentraci, zatímco skutečné polychromní roztoky se připravují definovanými oxidačními postupy a v případě barviv pro krev se kombinují s odměřeným množstvím eosinu. Historie je zde poučná: nestabilní vodné vyzrálé roztoky z 90. let 19. století ustoupily methanolovým stabilizovaným přípravkům právě proto, že nekontrolované směsi nebylo možné reprodukovat. To stojí za připomenutí, než začnete barvit diagnostický preparát z lahvičky nejasného stáří.

Důsledné rozlišování názvů celý postup uzavírá. Ověřte na etiketě katalogovou položku (vodná, Loefflerova nebo polychromní), obsah barviva a zamýšlené použití, místo abyste je odvozovali z barvy. Tyto tři přípravky mají společný výchozí chromofor. Nemají však společný účel.