Barvení buněk sliznice tváře methylenovou modří: co pozorovat

Studentka nanese kapku suspenze buněk sliznice tváře na podložní sklíčko, podívá se do mikroskopu a téměř nic nevidí. Světlým zorným polem se pohybuje několik bledých přízraků. Zkusí doostřit, potom přidá světlo a nakonec usoudí, že je sklíčko prázdné. Sklíčko ale prázdné není. Buňky tam jsou. Jsou téměř průhledné a právě průhlednost je problém, který má toto barvení vyřešit.

Tento nesoulad mezi očekáváním a obrazem stojí za to pojmenovat ještě před zahájením postupu. Začátečníci čekají, že mikroskop odhalí detaily podobně jako zoom fotoaparátu přiblíží vzdálený nápis. Mikroskop pro pozorování ve světlém poli má užší úlohu: zobrazuje rozdíly v absorpci světla. Neobarvená buňka sliznice tváře neabsorbuje téměř žádné světlo, a proto vytváří jen nepatrný rozdíl. Methylenová modř tento rozdíl dodá. Uvnitř buňky se váže nerovnoměrně a převádí strukturu na kontrast. Jakmile studenti tento princip pochopí, každý další krok jim dává smysl jako jeho důsledek, nikoli jako položka v receptu.

Pomůže zde vysvětlení, jak jednoduchá barvení zvyšují kontrast ve školní laboratoři, a připomenutí nastavení mikroskopu pro pozorování ve světlém poli před barvením předejde polovině nepovedených preparátů. Chemické pozadí barvy rozebírá úvod do použití methylenové modři v mikroskopii, který vysvětluje, proč se právě toto barvivo na laboratorním stole objevuje tak často.

Postup pro výuku

Níže uvedená varianta nativního preparátu je jednodušší výchozí volbou pro běžnou výuku. Nepotřebuje plamen ani fixaci. Varianta s fixovaným nátěrem, používaná v některých vysokoškolských příručkách, přidává sušení na vzduchu a krátkou tepelnou fixaci, například v úloze s nátěrem buněk sliznice tváře od North Central Texas College zveřejněné na Biology LibreTexts, tepelná fixace je však běžnou mikrobiologickou praxí, nikoli podmínkou pro pozorování epitelových buněk.

Co budete potřebovat: čistá podložní a krycí sklíčka, sterilní jednorázové odběrové tampony (upřednostňovaná možnost) nebo nová plochá párátka, lahvičku s kapátkem s 0.5 až 1 procentním vodným roztokem methylenové modři, destilovanou nebo deionizovanou vodu, savý papír, rukavice a složený světelný mikroskop s celkovým zvětšením 100x a 400x.

1. Vypláchněte si ústa čistou vodou. Odstraníte tím zbytky potravy, které se později intenzivně obarví a odvádějí pozornost od buněk.
2. Každý student odebírá vzorek pouze z vlastní tváře. Novým sterilním tamponem jemně přetřete vnitřní stranu tváře. Přitlačujte, neškrábejte. Přestaňte dříve, než by se mohly objevit nepříjemné pocity nebo krvácení.
3. Tamponem otáčivým pohybem rozetřete tenkou vrstvu přes střed čistého podložního sklíčka. Tenká vrstva je nejdůležitějším předpokladem dobře čitelného preparátu. Silná bílá vrstva se obarví na neprůhlednou modrou hmotu.
4. Na nátěr přidejte jednu kapku methylenové modři. Nechte působit 1 až 3 minuty. V mnoha vysokoškolských postupech stačí jedna minuta; příručka NCERT pro přírodovědné laboratorní práce v IX. ročníku používá u dočasného preparátu přibližně 3 minuty. Delší doba není lepší a přebarvení je nejčastější chybou při časování.
5. Jemně opláchněte destilovanou vodou nebo odsajte přebytečné barvivo savým papírem podle místního postupu. Pozadí by mělo být světle modré, nikoli tmavě námořnicky modré.
6. Přikládejte krycí sklíčko šikmo, aby se nejprve dotkl jeden okraj, a potom je pomalu spouštějte. Tím zabráníte vzniku vzduchových bublin.
7. Začněte při malém zvětšení, vyhledejte buňky, ověřte zaostření a umístění ve středu zorného pole, potom přejděte na 100x a nakonec na 400x. Při 400x používejte pouze jemné ostření.

Koncentrace barviva si zaslouží jedno upřesnění. Školní postupy obvykle používají přibližně 1 procentní vodný roztok methylenové modři. Koncentrovanější zásobní roztok nebo dlouhé působení ztmavují pozadí rychleji než jádro, čímž obracejí kontrast, na kterém úloha závisí.

Bezpečná manipulace s materiálem ze sliznice tváře

Vzorky ze sliznice tváře obsahují sliny a běžné mikroorganismy ústní dutiny. S každým čerstvým nátěrem proto zacházejte jako s potenciálně infekčním materiálem, přestože pochází od zdravých spolužáků. Pokyny Americké mikrobiologické společnosti pro biologickou bezpečnost ve výukových laboratořích uvádějí obecné zásady: před výukou posoudit rizika, nosit rukavice, chránit oči tam, kde hrozí rozstřik, po práci si umýt ruce, dezinfikovat pracovní plochy a kontaminované jednorázové pomůcky likvidovat schváleným způsobem určeným pro biologický odpad.

Většinu rizik pokrývají čtyři pravidla pro výuku. Jeden dárce na jeden tampon a jedno sklíčko, nikdy je nesdílet. Odebírat vzorek pouze sobě, nikdy spolužákovi. Jednorázové tampony a párátka patří rovnou do určené nádoby na odpad, nikdy zpět na pracovní stůl. Samotná methylenová modř barví kůži a oděv a dráždí oči, proto používejte rukavice a dodržujte běžné hygienické zásady pro práci s barvivy. Nerozšiřujte tuto úlohu o kultivaci čehokoli z nátěru a neimprovizujte tepelnou fixaci čerstvého lidského materiálu mimo školní bezpečnostní postup.

Co pozorovat a proč to tak vypadá

Při 100x hledejte široké ploché, světle modré buňky s nepravidelně oválnými nebo mnohoúhelníkovými obrysy. Leží jednotlivě nebo v řídce uspořádaných překrývajících se vrstvách. Každá buňka obvykle obsahuje jednu tmavší modrou skvrnu. Tato skvrna je jádro. Všímejte si také uspořádání: buňky dlaždicového epitelu mají podobu tenkých destiček, nikoli koulí, a proto jejich okraje připomínají spíše popraskanou glazuru než kulaté balónky.

Při 400x lze jasně rozlišit tři znaky. Hranice buňky se jeví jako tenká tmavší čára ohraničující buňku. Cytoplazma vyplňuje vnitřek světlou rovnoměrnou modří. Jádro je tmavší a kompaktnější, často oválné, obvykle blízko středu, ale ne vždy. Požádejte studenty, aby zaznamenali všechny tři znaky spolu s tvarem a zvětšením, protože přesně to vyžaduje pracovní list.

Zde je důležité jedno upřesnění, které mnoho pracovních listů uvádí nesprávně. Viditelná hranice odpovídá oblasti plazmatické membrány, ale samotná membrána, lipidová dvojvrstva o tloušťce přibližně 7 až 10 nanometrů, je hluboko pod rozlišovací schopností školního mikroskopu. Studenti vidí optický okraj buňky spolu s barvivem, které se tam nahromadilo. Stejná opatrnost platí pro organely. Mitochondrie, endoplazmatické retikulum, Golgiho aparát ani ribozomy v tomto preparátu viditelné nejsou. Běžný světelný mikroskop za dobrých podmínek rozliší detaily přibližně do 0.2 mikrometru, jak vysvětluje přehled mikroskopických nástrojů pro buněčnou biologii na NCBI, a většina ultrastruktury se nachází pod touto hranicí nebo v její blízkosti. Vyšší prázdné zvětšení zvětší obraz, aniž by přidalo detaily.

Proč se jádro barví nejtmavěji? Methylenová modř je kationtové barvivo, které má v roztoku kladný náboj a váže se na záporně nabitý materiál v buňce, především na nukleové kyseliny. Chromatin soustřeďuje DNA v jádře, a proto se v jádře hromadí nejvíce barviva. Cytoplazma obsahuje RNA a další nabité molekuly, takže se barví také, ale rozptýleněji a světleji. Důležité upřesnění: methylenová modř není barvivo specifické pro DNA. Práce o rozložení methylenové modři při zobrazování buněčných jader popisuje vazbu kationtu na oblasti bohaté na nukleové kyseliny a starší kvantitativní práce o vazbě methylenové modři v buněčných preparátech zjistila, že většina navázaného barviva je spojena s nukleovými kyselinami. Tmavé jádro a světlá cytoplazma jsou tedy vzorcem kontrastu, nikoli molekulárním testem.

Chyby, kterých se studenti dopustí, a jak je rozpoznat

Téměř každý nepovedený preparát odpovídá jednomu z pěti typických problémů. Naučte studenty rozpoznat problém v preparátu místo toho, aby jej slepě připravovali znovu.

Přebarvení ztmaví buňky i pozadí rovnoměrně, takže jádro v zorném poli zanikne. Nápravou je kratší doba barvení nebo důkladnější oplach. Nedostatečné obarvení zanechává bledé přízraky, které při zvýšení osvětlení zmizí; prodlužujte dobu po třiceti sekundách. Silné nátěry vytvářejí husté překrývající se shluky, v nichž nelze sledovat žádný obrys; náprava je mechanická, příště rozetřete tenčí vrstvu, protože žádný oplach hromadu buněk nezachrání. Vzduchové bubliny vypadají jako dokonalé kruhy s ostrými tmavými okraji a odvádějí pozornost začátečníků, kteří je zaměňují za buněčné struktury; krycí sklíčko znovu přiložte pomalu a šikmo. Drobné tmavé tečky rozptýlené na buňkách nebo kolem nich jsou obvykle běžné bakterie ústní dutiny, jak uvádějí školní postupy, například postup pozorování buněk sliznice tváře od Ingrid Science. Potvrzují, že ústa mají své obyvatele, což může studentům utkvět v paměti, ale v této úloze je nelze určit na úroveň druhu a neměly by se zakreslovat jako součásti buněk. Zbytky potravy a vlákna hlenu se barví nepravidelně a intenzivně; právě k omezení jejich množství slouží úvodní vypláchnutí úst.

Co tato úloha nedokáže

Jde o výukové pozorování, nikoli diagnostický test. Z vzhledu buněk obarvených při školní výuce nelze diagnostikovat infekci, rakovinu ani jakékoli jiné onemocnění a článek nelze chápat tak, že naznačuje opak. Preparát ukazuje tvar, hranici buňky, cytoplazmu a jádro při dvou zvětšeních. Neukazuje ultrastrukturu membrány, detaily organel ani molekulární identitu. Výslovné uvedení tohoto omezení chrání vědeckou správnost i studenty: dobrým výsledkem je správně popsaná kresba se zaznamenaným zvětšením a barvivem, nikoli závěr o zdravotním stavu.

Pracovní list pro studenty a mikrofotografie s popisky

Dvěma podklady pro práci na této stránce jsou mikrofotografie s popisky výše a pracovní list níže. Vytiskněte pracovní list pro každého studenta nebo jej promítněte a nechte studenty překreslit rámečky do sešitů.

Jak jej využít během 45 minut: deset minut na bezpečnostní pokyny a odběr vzorků, deset minut na barvení a přípravu preparátu, patnáct minut na pozorování a kreslení při obou zvětšeních, deset minut na kontrolní seznam a porovnání s mikrofotografií s popisky. Položky kontrolního seznamu jsou záměrně přímočaré. Tenký nátěr, správná doba barvení, jádro tmavší než cytoplazma, zaznamenané zvětšení. Student, který může zaškrtnout všechny čtyři, pochopil princip, který má tato hodina naučit: mikroskopy zobrazují rozdíly a barviva vytvářejí rozdíly, které stojí za to zobrazit.