Mjerenje reaktivnih vrsta kisika u eksperimentima s metilenskim plavilom

Dvije laboratorije provode ono što svaka naziva eksperimentom antioksidativnog djelovanja metilenskog plavila. Jedna izvještava da boja potiskuje reaktivne vrste kisika. Druga izvještava da ih stvara. Obje prikazuju jasne krivulje odnosa doze i odgovora. Obje su iskrene. Razlika nije u prevari ili nestručnosti. Stvar je u tome što su dvije grupe mjerile različite pojave pod različitim osvjetljenjem, sondama koje odgovaraju na različita pitanja, a zatim oba odgovora opisale istom riječju: ROS.

Metilensko plavilo je molekula koju je teško precizno mjeriti jer učestvuje u hemijskim procesima koje bi trebalo posmatrati. U mraku prenosi elektrone između donora i akceptora i vraća se u početni oblik, spremno za novi ciklus. Pod svjetlošću postaje fotosenzibilizator, dostižući pobuđeno tripletno stanje iz kojeg može prenijeti energiju na kisik i stvoriti singletni kisik ili prenijeti elektrone i stvoriti radikale i vodikov peroksid. Svaka sonda unesena u taj sistem može biti oksidirana, reducirana, izblijedjela ili optički zaklonjena samom bojom. Zato prvo pitanje pri svakom očitanju ROS-a nikada nije koliki je broj. Pitanje je šta test zapravo detektuje i šta boja radi samom testu.

Amplex Red: kalibrirani test vodikovog peroksida

Kombinacija metilenskog plavila i Amplex Red predstavlja najpouzdaniji spoj u ovoj literaturi kada je pravilno postavljena. Hemijska reakcija je specifična: peroksidaza iz hrena koristi vodikov peroksid da oksidira supstrat Amplex u fluorescentni proizvod, rezorufin, u približnom stehiometrijskom odnosu jedan prema jedan. Peroksid iz uzorka pretvara se u fluorescenciju koju bilježi detektor. Nijedna druga vrsta iz uobičajene grupe ROS-a ne pokreće tu reakciju direktno.

Presudna prednost je kalibracija. Pažljiv istraživač ispituje poznate standarde peroksida u istom puferu, s istim koncentracijama peroksidaze i supstrata, istim vremenom inkubacije i istim optičkim postavkama, a zatim očitava uzorke prema toj krivulji. U studiji izoliranih mitohondrija mozga na kojoj se ova metoda zasniva, autori su uradili upravo to, dodajući poznate količine peroksida na kraju svakog mjerenja, a rezultate su izrazili kao brzine u pikomolima u minuti po miligramu proteina, umjesto u proizvoljnim jedinicama fluorescencije. Upravo to pretvara svjetlucanje u mjerenje.

Tri detalja iz te studije vrijedi slijediti. Prvo, autori su provjerili signal katalazom, koja razgrađuje peroksid. Porast fluorescencije izazvan metilenskim plavilom prestao je nakon dodavanja katalaze, što je potvrdilo da signal potiče od peroksida, a ne od optičkog artefakta. Drugo, direktno su ispitali utjecaj osvjetljenja zaklanjanjem ekscitacijskog snopa tako da su uzorci primali jednu osminu uobičajene doze svjetlosti, a signal se smanjio za samo devet posto. Više od devedeset posto peroksida o kojem su izvijestili bilo je nezavisno od svjetlosti korištene za mjerenje. Treće, zasebno su elektrodnom metodom izmjerili uklanjanje peroksida i utvrdili da boja istovremeno povećava njegovo stvaranje i usporava uklanjanje. Sonda koja izvještava samo o neto fluorescenciji spojila bi ta dva učinka u jedan.

Test ipak ima slabe tačke, a metilensko plavilo aktivira nekoliko njih. Boja apsorbira u širokom dijelu istog crvenog područja u kojem rezorufin emitira, pa pri visokim koncentracijama boje uzorak može zakloniti vlastiti signal zbog efekata unutrašnjeg filtra. Standardi zato trebaju sadržavati istu koncentraciju boje kao i uzorci. Amplex Red može i sam fotoooksidirati, a njegov proizvod rezorufin može ući u fotoredoks cikluse koji stvaraju superoksid i peroksid, što je posebno važno kada se u eksperimentu osvjetljava i fotosenzibilizator. Praktično rješenje je prvo ozračiti uzorke metilenskog plavila, a zatim ispitati alikvote reagensima Amplex u mraku, umjesto da se boja i sonda osvjetljavaju zajedno. Konačno, superoksid-dismutaza ne potiskuje jednostavno signal Amplex: pretvaranje superoksida u peroksid može ga povećati. Kontrola sa SOD-om koja povećava fluorescenciju nije neuspjela. Ona je prepoznala superoksid kao vrstu koja prethodi peroksidu u reakcijskom putu.

DCFDA: nespecifični pokazatelj oksidacije

Kombinacija metilenskog plavila i DCFDA izvor je većine zabune. DCFH-DA je prekursor za unošenje sonde u ćelije. Esteraze unutar ćelije uklanjaju njegove acetatne grupe, ostavljajući nefluorescentni DCFH, a oksidacijom DCFH nastaje fluorescentni DCF. Spisak onoga što ga oksidira je dug: hidroksilni radikali, intermedijeri peroksidaze i hema, dušikov dioksid, hipohlorasta kiselina i radikali nastali iz peroksinitrita. Sam vodikov peroksid ne oksidira ga direktno brzinom korisnom za mjerenje; fluorescencija zavisna od peroksida uglavnom zahtijeva učešće željeza, hemoproteina ili peroksidaznih reakcija.

Kritika koju bi svaki odjeljak o metodama trebao citirati potiče iz analize DCFH kao sonde koju su proveli Kalyanaraman i saradnici, sažete u studiji mitohondrija mozga koja je iz tog razloga odbacila DCFDA. Oni su pokazali da boja reagira sporo, uz neodređenu stehiometriju, bez valjane kalibracije i sa spojevima koji nisu ROS. Sonda također pojačava ono što mjeri: jednoelektronska oksidacija DCFH stvara DCF radikal koji reagira s kisikom i stvara superoksid, čijom dismutacijom nastaje dodatni peroksid. Očitanje djelimično samo stvara hemijske procese o kojima izvještava.

Ništa od toga ne čini DCFDA beskorisnim. To ga čini alatom za preliminarno ispitivanje, a ne za identifikaciju. Porast fluorescencije DCF-a znači da se povećala oksidacija sonde zavisna od oksidansa. To ne znači da se povećala količina peroksida, a svakako ne znači da se povećao ukupni ROS, veličina koju nijedna pojedinačna sonda ne mjeri. Raniji radovi s metilenskim plavilom koji su se oslanjali na oksidaciju DCF-a pri koncentracijama iznad jednog mikromola po litru izvještavali su o prooksidativnim učincima, dok su drugi sistemi u istom periodu pokazivali zaštitu od ćelijske smrti izazvane peroksidom. Oba opažanja mogu biti tačna za istu boju u različitim redoks uslovima, a sam rezultat DCF-a ne može pokazati koji je oksidans nosio signal. Važnost ranijeg rada na mitohondrijima mozga leži u tome što je ovo preliminarno ispitivanje zamijenio kalibriranim mjerenjem peroksida i direktno utvrdio opterećenje: čak je i koncentracija boje od sto nanomola po litru višestruko povećala oslobađanje peroksida pri svakom ispitanom supstratu i respiratornom stanju.

DCFDA nosi još jednu zamku specifičnu za metilensko plavilo. Boja je intenzivno obojena i redoks aktivna, pa može izblijediti fluorescenciju, ugasiti emisiju ili oksidirati sondu nezavisno od ćelijskog ROS-a. Kontrola bez ćelija, koja sadrži boju i sondu, nije neobavezan dodatak. To je eksperiment koji pokazuje da li boja djeluje na sondu.

Hvatanje radikala spin-zamkama i potrošnja kisika: identitet i tok

Dok fluorescentne sonde pokazuju da se pojavilo nešto što može izazvati oksidaciju, elektronska spinska rezonancija sa spin-zamkama daje odgovor bliži tome šta je to bilo. Klasična studija fotohemije metilenskog plavila koristila je ESR za detekciju askorbatnog radikala nastalog iz boje, askorbata i svjetlosti, a zatim je pokazala stvaranje peroksida u eksperimentima potrošnje kisika i stvaranje hidroksilnih radikala katalizirano željezom u eksperimentima sa spin-zamkama. Svaka tehnika odgovorila je na pitanje na koje druge nisu mogle: ESR je utvrdio identitet radikala, potrošnja kisika pokazala je reakcijski tok nezavisno od bilo kakve fluorescentne sonde, a njihova kombinacija pokazala je da u istom osvijetljenom sistemu djeluju i put singletnog kisika i radikalski putevi.

Taj rezultat iz 1984 i dalje zvuči kao upozorenje. Uz osvjetljenje i prisustvo redukcijskog sredstva, boja je stvarala peroksid, a uz prisustvo željeza sistem je proizvodio hidroksilni radikal, najreaktivniju vrstu u toj grupi. Autori su to povezali s askorbatom u oku i doveli u pitanje nekritičku oftalmološku upotrebu. Današnji čitaoci trebaju obratiti pažnju na uslove: svjetlost plus redukcijsko sredstvo plus željezo. Uklanjanjem bilo kojeg od njih taj reakcijski put slabi ili nestaje.

Kisikove elektrode opravdavaju svoju ulogu na drugačiji način. Elektroda Clarkovog tipa mjeri neto potrošnju kisika, čime utvrđuje da redoks reakcije pokrenute bojom troše molekularni kisik i daje kinetičke podatke koje nikakav artefakt fluorescencije ne može oponašati. Ona ne identificira proizvod. Stvaranje peroksida, superoksida i vode te raspad singletnog kisika troše kisik. Tok bez identiteta jednako je nepotpun kao identitet bez toka, zbog čega kvalitetni radovi uparuju elektrodu s kalibriranim testom peroksida ili zamkom.

Zašto su rezultati o antioksidativnom djelovanju proturječni

Kada se ova tri očitanja stave jedno uz drugo, prividne proturječnosti u literaturi o metilenskom plavilu svode se na razlike u metodama i tri biološke činjenice.

Prvo, boja je istovremeno prenosilac elektrona i izvor peroksida. Preusmjeravanjem elektrona s respiratornih mjesta na kojima bi kisik inače postao superoksid može smanjiti jednu vrstu ROS-a, dok njen reducirani oblik direktno reducira kisik u peroksid, povećavajući drugu. Laboratorija koja se bavi mitohondrijskom redoks hemijom i ulogom metilenskog plavila u zaobilaženju uobičajenih puteva zato treba očekivati odgovore koji zavise od sonde: očitanje osjetljivo na superoksid pada, dok očitanje peroksida raste u istoj kiveti.

Drugo, peroksid u malim dozama predstavlja signal, a ne samo oštećenje. Studija mitohondrija mišjeg mozga koja je uslijedila nakon ranijeg rada utvrdila je stvaranje peroksida već pri koncentraciji boje od pedeset nanomola po litru, bez oštećenja mitohondrijske DNK pri terapijskim koncentracijama, uz zaštitu od oštećenja izazvanih rotenonom nakon prethodnog tretmana. Tek pri koncentraciji od sto mikromola po litru, daleko iznad terapijskog raspona, boja je oštetila odabrane fragmente DNK, a crvena svjetlost uz koncentraciju boje od dvadeset mikromola po litru proizvela je singletni kisik koji je oštetio sve ispitane fragmente. Predloženi mehanizam je hormetički: blago stvaranje peroksida pokreće antioksidativne odbrambene mehanizme povezane s Nrf2 i mitohondrijsku biogenezu, pa kratkoročno prooksidativno očitanje prethodi dugoročnijem antioksidativnom ishodu. Test očitan nakon jednog sata i test očitan nakon jednog dana mogu dati različite rezultate jer se biologija u međuvremenu promijenila.

Treće, svjetlost određuje čak i koja je molekula prisutna. Osvjetljenje demetilira boju prema Azure B i srodnim proizvodima, a mikroskopska lampa iznad posude dovoljna je da je fotosenzibilizira. Eksperimenti u mraku i pod osvjetljenjem različiti su eksperimenti, a odjeljak o kontrolama osvjetljenja i rukovanja bojom u svakom protokolu treba ih tako i tretirati.

Minimalni skup kontrola i kako tumačiti svaku tvrdnju

Poređenje u nastavku izvorni je referentni materijal za ovaj članak. Prije nego što prihvatite bilo koji rezultat mjerenja ROS-a uz metilensko plavilo, provjerite koje su stavke autori obuhvatili, a koje preskočili.

Iz toga slijedi praktično pravilo tumačenja. Kalibrirani Amplex s peroksidazom i provjerom katalazom pruža dokaz o peroksidu. DCFDA pruža dokaz o nespecifičnoj oksidaciji sonde i ništa više. Hvatanje radikala spin-zamkama uz kontrole sa hvatačima radikala pruža dokaz o identitetu radikala. Potrošnja kisika pruža dokaz o toku. Rečenica koja tvrdi više nego što njen test može potkrijepiti, koliko god samouvjereno bila napisana, govori o sondi, a ne o boji. Povezane rasprave o zavisnosti od doze i hormetičkom rasponu, mitohondrijskom toku elektrona, ometanju testova u obojenim uzorcima i artefaktima mikroskopskog osvjetljenja proširuju svaku od ovih tačaka, a svaka ostaje važeća i nakon što se njena privremena referenca zamijeni.