Metilensko plavo kao anaerobni indikator i indikator kisika: šta dokazuje promjena boje

Tehničarka zatvara anaerobnu posudu, kroz poklopac provjerava indikatorsku traku s metilenskim plavim i vidi ono što želi vidjeti. Traka je iz plave prešla u bijelu. Bilježi postupak kao anaeroban i nastavlja dalje. Dva dana kasnije na jednoj ploči nema rasta, dok zatvorena epruveta s bujonom u istoj posudi pokazuje znakove izloženosti kisiku. Traka je govorila istinu. Tehničarka joj je postavila pogrešno pitanje.

Zabuna proizlazi iz miješanja pojmova. Anaerobni indikator s metilenskim plavim zasniva se na redoks uslovima, a ne na sterilnosti niti na validaciji cijelog sistema. Kada ta razlika postane jasna, traka postaje precizan i pouzdan instrument s usko definisanim zadatkom.

Princip: reverzibilni redoks par

Rastvoreno metilensko plavo postoji u dva stanja. Oksidirani oblik je poznati plavi kation. Reducirani oblik, nazvan leukometilensko plavo, bezbojan je. Pri približno neutralnom pH, pojednostavljena polureakcija podrazumijeva da jedan plavi kation, jedan proton i dva elektrona daju jednu bezbojnu leukomolekulu. Formalni potencijal iznosi približno plus 11 milivolti u odnosu na standardnu vodikovu elektrodu pri pH 7, što ga smješta u raspon koji mnogi redukcijski sistemi mogu postići i u kojem kisik može preokrenuti reakciju.

Za redukciju je potreban nizak lokalni redoks potencijal. Samo uklanjanje kisika nije uvijek dovoljno. Rana istraživanja anaerobnih uslova pokazala su da metilensko plavo u običnoj vodi bez kisika zadržava boju ako nije prisutna redukcijska supstanca te da se smjese dekstroznog bujona s približno 0.01 posto boje lako obezboje na 37 C, dok ista smjesa držana na 4 C ostaje plava jedan dan, kako je opisano u eksperimentima sa svježim tkivom i anaerobnim uslovima uzgoja. Temperatura, pH, glukoza, askorbat, tioglikolat i redukcijska aktivnost mikroorganizama određuju jesu li elektroni dostupni.

Za ponovnu oksidaciju dovoljan je kisik. Kada zrak dođe do leukooblika, on ponovo postaje plav. Savremeni namjenski razvijeni indikatori koriste upravo ovaj ciklus: boja, redukcijsko sredstvo i stabilizirajuća matrica, bezbojni pri niskom nivou kisika i ponovo plavi nakon izlaganja zraku, kao što je pokazano u hibridnom indikatoru kisika s metilenskim plavim na bazi boje, redukcijskog sredstva, površinski aktivne supstance i gline. Taj prototip koristio je 0.01 milimolarnu boju s 2.0 milimolarnim askorbatom ili glukozom pri pH 11, postajao bezbojan pri približno 0.5 zapreminskih posto kisika i u svojoj ispitnoj komori razlikovao nivoe ispod 0.1 posto od nivoa iznad 0.5 posto kisika.

Dakle, princip rada je jednostavan. Plava boja znači da je indikatorska zona oksidirana. Bezbojnost znači da su u indikatorskoj zoni postignuti redukcijski uslovi s malo kisika. Promjena je reverzibilna, lokalna i hemijska. Sama po sebi ne govori ništa o mikroorganizmima.

Kako radi indikatorska traka s metilenskim plavim u anaerobnoj posudi

Indikatorska traka s metilenskim plavim za anaerobnu posudu mala je reakcijska zona postavljena u atmosferu posude tako da se može vidjeti bez njenog otvaranja. Komercijalni oblici se razlikuju: papirne trake, tablete koje se rastvaraju ili navlaže pri pripremi te noviji hibridni papiri. Nekima je potrebna jedna kap destilirane vode za aktiviranje reakcijske zone. Drugi su indikatori u suhom obliku koji moraju ostati suhi. Mjerodavno je uputstvo za konkretan proizvod jer su vlaženje, položaj i vrijeme očitavanja dio hemijskog procesa.

Predviđeno očitavanje u praksi je binarno. Plava boja znači da su na traci i dalje prisutni kisik ili nedovoljno redukcijski uslovi. Bijela boja ili bezbojnost znači da su na traci uspostavljeni anaerobni redoks uslovi. Nekim komercijalnim papirima dodan je crveni pozadinski pigment, pa je njihov krajnji reducirani oblik ružičast umjesto bijel. Prije procjene saznajte koji krajnji izgled vaš proizvod treba imati.

Vrijeme zavisi od sistema. U jednoj postavci tipa GasPak boja je počela blijediti unutar približno jednog sata, a potpuno je nestala unutar nekoliko sati, dok je u kontrolisanom poređenju na sobnoj temperaturi metilenskom plavom trebalo više od šest sati. Redoks potencijal podloge u tom istraživanju dostigao je približno minus 100 milivolti unutar 60 do 100 minuta, znatno prije nego što je boja završila promjenu, a do trenutka kada je traka postala potpuno bezbojna bio je znatno ispod minus 200 milivolti. Indikator kasni za promjenama u atmosferi. Plava traka nakon jednog sata ne dokazuje neuspjeh, a bijela traka nakon šest sati opisuje stanje trake u šestom satu.

Položaj je važan iz istog razloga. Držite traku u gasnom prostoru posude, vidljivu kroz poklopac, dalje od površina agara i podloga za uzgoj. Ona pokazuje stanje svoje neposredne okoline. Ako je položite uz hladan zid, zatrpate pločama ili dopustite da je natopi kondenzat, pokazivat će stanje tog mikrookruženja umjesto atmosfere posude.

Šta traka pokazuje, a šta ne

Posmatrajte indikator s metilenskim plavim u anaerobnoj posudi kao jedan senzor na jednom mjestu. On pokazuje lokalne redoks uslove i uslove u pogledu kisika u vlastitoj reakcijskoj zoni, koji su uglavnom reprezentativni za gasni prostor ako su miješanje i uspostavljanje ravnoteže odgovarajući. Sve izvan toga je zaključivanje, a za zaključivanje su potrebni zasebni dokazi.

Bezbojna traka ne potvrđuje sterilnost. Sterilnost je odsustvo živih organizama, dokazano validiranom sterilizacijom i kontrolama za validaciju uzgoja kultura. Posuda može biti potpuno anaerobna, a ipak kontaminirana, ili potpuno sterilna, a ipak aerobna.

Traka ne validira svaki dio sistema za uzgoj kultura. Rastvoreni kisik u zatvorenoj epruveti, kisik zarobljen duboko u agaru, gradijenti u pretrpanoj posudi i propuštanje koje se pojavi nakon očitavanja izmiču jednoj traci. Eksperimenti s prostornim rasporedom pokazali su susjedne plave i bezbojne zone u istoj posudi, gdje su prodor kisika i redukcijska aktivnost bili u različitoj ravnoteži. Jedna tačka ne može potvrditi stanje cijele zapremine.

Traka ne dokazuje neprekinute anaerobne uslove. Jedno očitavanje trake pri pripremi ne govori ništa o dvadesetom satu. Novija istraživanja kvaliteta anaerobnih uslova upozoravaju da hemijski indikatori opisuju atmosferu u trenutku očitavanja i mogu izgledati zadovoljavajuće uprkos maloj količini preostalog kisika. Kontinuirano dokumentovanje ili dokumentovanje na kontrolnim tačkama, a ne jedan pogled na kraju, povezuje očitanje trake s tokom inkubacije.

Za hemijsku pozadinu promjene boje pogledajte kako metilensko plavo prelazi između oksidiranog i reduciranog stanja. Za širi pregled utjecaja kisika na rukovanje uzorcima pogledajte kontrolu kisika u mikroskopiji i uzgoju kultura.

Dijagram koji vrijedi držati uz posudu

Slika u nastavku sažima članak u jedan podsjetnik za laboratorijski rad. Tri stanja iste trake, dva smjera reakcije i granica između onoga što indikator dokazuje i validacije sistema.

Uzroci problema koji održavaju traku plavom ili daju lažnu sigurnost

Većina problema spada u pet grupa. Svaka ima prepoznatljive znakove.

Posuda ili vrećica koja propušta stalno dovodi kisik u reakcijsku zonu. Traka ostaje plava ili ponovo poplavi nakon blijeđenja. Prije nego što uzrok pripišete hemiji, provjerite poklopac, brtvu, stezaljke i zaptivne površine.

Istrošen ili nepravilno aktiviran generator gasa ne uklanja kisik. U starijim sistemima koji se aktiviraju vodom, izostanak kondenzacije nakon približno 10 do 15 minuta i izostanak zagrijavanja poklopca nakon približno 20 do 40 minuta bili su rani znakovi upozorenja za taj sistem. Vrećica nedovoljnog kapaciteta u preopterećenoj posudi dovodi do istog problema.

Otrovan katalizator odnosi se samo na starije sisteme s vodikom i paladijem, u kojima paladij omogućava spajanje vodika i kisika u vodu. Vlaga i sumporovodik smanjuju njegovu aktivnost. Mnoge savremene vrećice uopće ne koriste paladij, pa nemojte primjenjivati ovu korektivnu mjeru tamo gdje nije relevantna.

Degradirana traka ili traka kojom se nepravilno rukovalo može otkazati bez očitih znakova. Boja i redukcijsko sredstvo tokom skladištenja gube reverzibilnost, što je jedan od razloga razvoja hibridnih formulacija otpornih na blijeđenje pod utjecajem svjetlosti i gubitak funkcije tokom skladištenja. Odbacite zalihe kojima je istekao rok upotrebe, zalihe s neuobičajenom početnom bojom i trake koje su navlažene iako trebaju biti suhe ili ostavljene suhe iako zahtijevaju vlaženje.

Gradijent ili kašnjenje dovode u zabludu osobu koja očitava, a ne remete hemijski proces. Slabo izmiješan gasni prostor, zatvorene epruvete s rastvorenim kisikom i polučvrste podloge zadržavaju vlastite uslove duže nego što traka sugeriše. Resazurinske trake prolaze kroz ružičasto stanje do bezbojnosti i često se reklamiraju kao brže, ali njihovi pragovi vezani su za vlastitu formulaciju i ne mogu se prenijeti na metilensko plavo.

Kontrole i protokol očitavanja koji vrijedi preuzeti

Dvije jeftine kontrole otkrivaju većinu pogrešnih očitavanja. Uz postupak držite svježu kontrolnu traku izloženu sobnom zraku. Ispravna traka s metilenskim plavim tu ostaje plava. Neki zapakovani indikatori u početku su blijedi i poplave pri otvaranju, što je samo po sebi provjera funkcionalnosti. Također povremeno stavite svježu traku u prethodno validiranu anaerobnu postavku. Trebala bi dostići validirano krajnje reducirano stanje unutar vremena navedenog za proizvod. Ako bilo koja kontrola odstupa od očekivanog ponašanja, zamijenite seriju prije nego što se oslonite na očitanja iz posude.

Protokol očitavanja proizlazi iz mehanizma. Postavite traku u gasni prostor tako da bude vidljiva bez otvaranja posude, slijedeći uputstvo za proizvod u pogledu kontakta sa zidom i vlaženja. Zabilježite početnu boju, vrijeme zatvaranja posude i boju na kontrolnoj tački navedenoj za proizvod. Gdje posuda to omogućava, zabilježite da je indikator ostao reduciran na definisanim kontrolnim tačkama tokom inkubacije. Zabilježite završnu boju neposredno prije otvaranja. Ta boja prije otvaranja predstavlja krajnji rezultat tog postupka. Nakon otvaranja očekujte ponovno plavljenje i ne dopustite da ono promijeni tumačenje prethodnog stanja.

Ako traka ostane plava nakon propisanog vremena, smatrajte anaerobne uslove nepotvrđenim. Provjeravajte redom: zaptivanje, vrećicu, katalizator ako je prisutan, vlaženje i rok upotrebe indikatora, a zatim funkcionalnost indikatora u poređenju s kontrolom na zraku. Tek kada je atmosfera potvrđena, treba tumačiti rast ili izostanak rasta, uz postavku za anaerobni uzgoj i kontrole organizama prilagođene namjeni.

Traka zaslužuje posljednju riječ u svom području. Plava ili bezbojna, odgovara na jedno pitanje o jednom mjestu u jednom trenutku. Postavite joj to pitanje u predviđeno vrijeme, uz odgovarajuće kontrole, i odgovorit će pouzdano. Ako je jednim pogledom pokušate pitati o sterilnosti, svakoj epruveti ili cijeloj inkubaciji, nikakva hemija indikatora ne može spasiti takvo tumačenje.