Antimikrobna i antifungalna istraživanja metilenskog plavog: svjetlo naspram mraka

Dva čitaoca vide izraz antimikrobno djelovanje metilenskog plavog i zamišljaju različite stvari. Jedan zamišlja plavu tečnost koja truje mikrobe pri kontaktu. Drugi zamišlja postupak u kojem ih boja zajedno s crvenim svjetlom uništava. Obje predodžbe sadrže dio istine. Nijedna nije potpuna, a njihovo miješanje izvor je većine pogrešnih tvrdnji na internetu.

Ta razlika predmet je ovog pregleda. Metilensko plavo pri dovoljnoj koncentraciji ima umjerenu toksičnost u mraku. Uz crveno svjetlo postaje fotosenzibilizator: apsorbira foton, prelazi u reaktivno tripletno stanje i pokreće oksidativne hemijske reakcije koje istovremeno oštećuju brojne mete. Taj režim aktiviran svjetlom ima vlastiti naziv, antimikrobna fotodinamička terapija, i vlastite uslove. Sama koncentracija ga ne određuje. Talasna dužina, doza svjetlosti, inkubacija, kisik i organizam određuju ishod.

Dva koncepta ubijanja

Prvo razmotrite koncept djelovanja u mraku. Metilensko plavo je pozitivno nabijena fenotiazinijska boja. Vezuje se za mikrobne ovojnice, ulazi u ćelije u različitoj mjeri i učestvuje u redoks reakcijama i reakcijama vezivanja. Fotoni nisu uključeni. Ubijanje se dešava, ali samo pri koncentracijama koje se znatno razlikuju zavisno od organizma, a mehanizam nema jednu jasno određenu metu.

Fotodinamički koncept dodaje svjetlo. Crveni fotoni u rasponu od približno 630 do 680 nm preklapaju se s apsorpcijskom trakom boje, pri čemu je maksimum monomera blizu 664 nm. Apsorpcija dovodi boju u kratkotrajno singletno stanje, a zatim u dugotrajnije tripletno stanje. Iz tog stanja slijede dvije grupe reakcija. U hemijskim reakcijama tipa I triplet prenosi elektron na supstrat i pokreće radikalske reakcijske puteve koji uključuju superoksidne i hidroksilne vrste. U hemijskim reakcijama tipa II direktno prenosi energiju na kisik u osnovnom stanju i stvara singletni kisik. Oba procesa mogu se odvijati istovremeno, pa je opisivanje boje kao sredstva koje djeluje isključivo putem singletnog kisika previše pojednostavljeno. Pregled odnosa strukture i aktivnosti fenotiazinijskih fotosenzibilizatora to direktno pokazuje: kod srodnih boja bakterijska fototoksičnost nije pratila samo prinos singletnog kisika, jer su unos, lokalizacija i redukcija u neaktivni leuko-oblik bili jednako važni kao fotofizika. Fotohemija koja stoji iza pravila o talasnoj dužini objašnjena je u pratećem pregledu boje u kombinaciji s crvenim svjetlom.

Singletni kisik ključan je za jedno korisno svojstvo. Reagira s brojnim biomolekulama istovremeno, pa je napad multifaktorijalan umjesto usmjeren na jedan enzim ili protein za vezivanje. Temeljni opis fotodinamičke antimikrobne hemoterapije predstavio je to kao razlog zbog kojeg uobičajeni profili rezistencije imaju malu važnost: dodatni protein koji veže penicilin ili mutirana topoizomeraza ne blokiraju nalet reaktivnog kisika. Ta logika potvrđena je u ispitivanjima na Staphylococcus aureus rezistentnom na meticilin i enterokokima rezistentnim na vankomicin, kako pokazuje tabela u nastavku. To ne znači da je rezistencija nemoguća, već da djeluje drugačije. Efluksne pumpe i antioksidativna odbrana i dalje mogu promijeniti potrebnu dozu, posebno kod gljivica.

Tabela organizama i modela istraživanja

Ova tabela je središnji dio članka. Svaka vrijednost specifična je za protokol: ista boja, drugačija doza svjetlosti ili inkubacija, drugačiji broj. Nemojte tumačiti MBC, MLC i MIC kao međusobno zamjenjive. MBC i MLC ovdje znače da pri presađivanju u novu kulturu nema preživjelih, dok MIC znači inhibiciju rasta. Uslovi osvjetljavanja navedeni su uz svaki unos.

Organizam i model	Rezultat u mraku	Rezultat uz svjetlo	Uslovi
S. aureus NCTC 6571, planktonska suspenzija	MBC 5 uM	MBC 5 uM	Tabela iz pregleda, bijelo svjetlo 12 J per cm2
S. aureus NCTC 6571, planktonska suspenzija	MLC 2.5 uM	MLC 1 uM	Protokol izvornog istraživanja iz 1997, 1.7 mW per cm2 tokom 1 sata, približno 6.3 J per cm2, inokulum približno 10^6 CFU per mL, navedeno u izvornom istraživanju fotobaktericidnog djelovanja fenotiazinijskih boja
MRSA EMRSA-15, planktonski oblik	MBC 80 uM	MBC 20 uM	Tabela iz pregleda, približno 12 J per cm2, četverostruko povećanje osjetljivosti
MRSA EMRSA-16, planktonski oblik	MBC 40 uM	MBC 10 uM	Isti protokol kao iznad
E. coli NCTC 9001, planktonski oblik	MBC 500 uM	MBC 100 uM	Isti protokol, peterostruko povećanje osjetljivosti
P. aeruginosa NCTC 10622, planktonski oblik	MBC 500 uM	MBC 25 uM	Isti protokol, dvadeseterostruko povećanje osjetljivosti
E. faecalis NCTC 775, planktonski oblik	MLC 100 uM	MLC 100 uM	Protokol iz 1997 pri 6.3 J per cm2, bez poboljšanja za ovaj soj i dozu
E. faecium rezistentan na vankomicin, planktonski oblik	MBC 400 uM	MBC 400 uM	Tabela iz pregleda, bez poboljšanja uz osnovnu boju, dok su hidrofobniji metilirani derivati donijeli poboljšanje, prema istraživanju enterokoka rezistentnog na vankomicin
Candida albicans, planktonski oblik	MIC iznad 12.79 ug per mL	MIC 12.79, 6.39 i 1.59 ug per mL pri 5, 10 i 15 J per cm2	Predinkubacija od 30 minuta u mraku, crveni LED 600 do 650 nm s maksimumom na 635 nm, prema istraživanju odnosa doze i odgovora pri antifungalnom fotodinamičkom djelovanju metilenskog plavog
C. albicans YEM14 naspram soja s prekomjernom ekspresijom efluksnih pumpi, ubijanje mjereno putem CFU	Nije primjenjivo	Približno 5 log smanjenja kod roditeljskog soja, gotovo nikakvo ubijanje soja s prekomjernom ekspresijom CDR1/CDR2	100 uM boje, inkubacija od 30 minuta, 660 nm pri 60 J per cm2, prema istraživanju utjecaja efluksnih pumpi na fotoubijanje metilenskim plavim
Hife naspram spora Trichophyton rubrum	Nije primjenjivo	MIC za hife približno 6.3 ug per mL, za spore približno 2.0 ug per mL; za potpunu blokadu CFU bilo je potrebno 5 ug per mL uz 100 J per cm2 za hife naspram 1.25 ug per mL uz 40 J per cm2 za spore	Fotodinamički protokol na 635 nm, prema istraživanju osjetljivosti razvojnih stadija dermatofita
Zreli subgingivalni biofilm od 33 vrste, uređaj Calgary, dan 6	Sam MB smanjio je ukupan broj za više od 80 posto	MB uz LED na 660 nm smanjio je metaboličku aktivnost za približno 55 posto, bez šire promjene strukture zajednice	0.01 posto boje (100 ug per mL), 660 nm pri približno 330 mW per cm2 tokom 5 minuta, anaerobni rast, prema in vitro istraživanju oralnog biofilma s više vrsta

Izdvajaju se tri obrasca. Prvo, gram-pozitivni stafilokoki umiru pri niskim mikromolarnim koncentracijama, dok gram-negativnim štapićima u mraku treba približno stotinu puta više boje, jer vanjska membrana gram-negativnih bakterija ograničava ulazak. Svjetlo smanjuje tu razliku, ali je ne uklanja. Drugo, antifungalno djelovanje metilenskog plavog postoji, ali zavisi od uslova: antifungalno ubijanje Candida metilenskim plavim naglo se povećava s dozom svjetlosti, a jedna fenotipska promjena, poput prekomjerne ekspresije efluksnih pumpi, može poništiti smanjenje od 5 log pri istoj dozi. Treće, zreli biofilm ponaša se drugačije od suspenzija, što objašnjava izdvojeni red o oralnom biofilmu.

Bakterije: gdje svjetlo najviše pomaže, a gdje ne

Stafilokoki su osjetljiv primjer. Čak su i vrijednosti za epidemijsku MRSA iz tabele pregleda jednake ili niže od vrijednosti za vankomicin korišten za poređenje kada se primijeni svjetlo, a dimetilirani derivati imali su još bolje rezultate jer je metilacija povećala lipofilnost i prinos singletnog kisika, uz otpornost na redukciju u leuko-oblik. Taj hemijski detalj je važan: pokazuje da je ubijanje rezultat dopremanja boje zajedno s fotofizikom, a ne same fotofizike.

Gram-negativni organizmi pokazuju važnost dopremanja boje. Pseudomonas je zahtijevao 500 uM u mraku i 25 uM uz svjetlo, što je dvadeseterostruko poboljšanje, ali vrijednost uz svjetlo i dalje je znatno iznad raspona za stafilokoke. Kationski naboj pomaže boji da se približi vanjskoj membrani, ali prodiranje ostaje ograničavajući faktor. Formulacije, vrijeme inkubacije i izbor derivata mijenjaju ove vrijednosti više nego ponavljanje primjene iste boje pri većoj dozi.

Enterokoki daju razlog za oprez. U starijim protokolima E. faecalis nije pokazao nikakvu prednost uz svjetlo, a E. faecium rezistentan na vankomicin zahtijevao je drugačiju molekulu umjesto više svjetla. Svako ko navodi jednu MBC vrijednost metilenskog plavog kao opću antibakterijsku konstantu pogrešno čita literaturu. Takva konstanta ne postoji. Postoje samo vrijednosti specifične za soj, podlogu, inokulum, inkubaciju, talasnu dužinu i fluencu. Kako čitati te vrijednosti bez samozavaravanja objašnjeno je u vodiču za tumačenje krivulja ubijanja.

Gljivice: osjetljive, ali stadij i pumpe odlučuju

Gljivični zidovi od glukana, manana i hitina predstavljaju drugačiji problem unosa nego kod bakterija, a gljivice imaju i aktivne odbrambene mehanizme. Navedeni rezultat efluksa kod Candida najupečatljiviji je primjer: ista boja, isto svjetlo, ista podloga, a ipak je soj s prekomjernom ekspresijom preživio dok je roditeljski soj izgubio približno 99.999 posto jedinica koje formiraju kolonije. Dermatofiti dodaju utjecaj razvojnog stadija. Spore umiru znatno lakše od hifa, pa protokol koji uklanja spore pri istoj dozi može ostaviti fragmente hifa sposobnim za život.

Zato izvještaji o antifungalnom djelovanju metilenskog plavog zahtijevaju jednako precizno određene uslove osvjetljavanja kao i izvještaji o bakterijama. Klinička fotodinamička istraživanja noktiju i kože kombinirala su 1 do 2 posto boje s izmjerenim crvenim svjetlom pri definiranim fluencama i praćenjem, a klinički izgled razmatrala su odvojeno od mikološkog uklanjanja gljivica. Ta ispitivanja pregledana su u sažetku fotodinamičkih dokaza o gljivicama noktiju i kože. Nanošenje razrijeđene boje na leziju pri sobnom svjetlu reproducira boju, ali izostavlja postupak.

Provjera biofilma: oralni model s 33 vrste

Istraživanje oralnog biofilma s više vrsta iz 2024 zaslužuje pažnju jer ispituje težak, a ne jednostavan slučaj. Trideset tri oralne vrste, uključujući Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythia, Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Fusobacterium i oralne streptokoke, rasle su anaerobno do zrelog biofilma na dan 6. Tretman je uključivao 0.01 posto boje i LED na 660 nm tokom 5 minuta pri visokoj iradijansi. I sama boja i samo svjetlo znatno su smanjili ukupan broj, a njihova kombinacija smanjila je metaboličku aktivnost približno za pola, ali struktura zajednice nije se promijenila i biofilm nije steriliziran.

To je stvaran učinak s jasno ograničenim dometom. Podržava fotodinamički tretman kao lokalni dodatak u očišćenom džepu, a ne kao sredstvo za ispiranje koje samo liječi dijagnosticirani parodontitis. Time dolazimo do općeg raskoraka.

Zašto laboratorijsko ubijanje nije isto što i liječenje

Određivanje planktonske MBC izlaže ujednačene ćelije ujednačenoj boji i ujednačenom svjetlu u podlozi obogaćenoj kisikom. Lezija ne pruža nijedan od tih uslova. Matrica usporava ulazak, stanja nalik perzistentnim ćelijama podnose oksidaciju, krv i eksudat apsorbiraju svjetlo, geometrija tkiva ostavlja sjene, a hipoksični džepovi slabe hemijske reakcije tipa II jer je za stvaranje singletnog kisika po definiciji potreban molekularni kisik. Mješovite infekcije uključuju vrste koje se razlikuju po unosu i osjetljivosti, pa jedna vrijednost za referentni soj ne može predstavljati mjesto infekcije.

Oralni primjer jasno pokazuje taj raskorak. Smanjenje broja Porphyromonas ili streptokoka na laboratorijskoj ploči, ili smanjenje biofilma uzgojenog u kulturi za pola, ne dokazuje da plavo sredstvo za ispiranje liječi parodontitis, izlječuje endodontsku infekciju ili uklanja bakterijemiju. Klinička parodontološka njega zavisi od mehaničkog razbijanja i uklanjanja biofilma te zbrinjavanja anatomije džepa, dok se tretman svjetlom istražuje kao lokalizirani dodatak. Koncentracija boje koja ubija u laboratorijskom udubljenju nema stalan odnos s koncentracijom koja dopire do bakterija ispod ruba desni, a sobno svjetlo nije doza na 660 nm. Granice doziranja, sigurnosti i interakcija za bilo kakvu oralnu upotrebu treba odrediti s kliničarem, kako je opisano u referentnom pregledu sigurnosti i interakcija.

Šta ovi dokazi ne predstavljaju

Oni ne predstavljaju tvrdnju o dezinfekcijskom sredstvu za domaćinstvo. Baktericidne tabele koriste definirane sojeve, podloge, vremena kontakta, spektre i fluence. Ne govore ništa o kuhinjskim površinama, potrebnom vremenu kontakta u prisustvu organskih nečistoća ili regulatornim standardima dezinfekcije.

Ne predstavljaju ni zamjenu za sistemske antibiotike. Uobičajeno fotodinamičko djelovanje zahtijeva boju, apsorbirano svjetlo i kisik na istom mjestu u isto vrijeme. Svjetlo ne dopire do dubokih ili raspršenih mjesta infekcije onako kako progutani lijek dospijeva u krv. Literatura ovaj pristup razmatra za dostupne lokalne infekcije ili kao dodatak, upravo onako kako je Wainwright od početka predstavio lokalnu dezinfekciju.

Uravnotežen sažetak je uži i još uvijek zanimljiv. Metilensko plavo ima umjereno antimikrobno djelovanje u mraku, a crveno svjetlo omogućava znatno veći fotodinamički učinak na brojne bakterije i gljivice, uz velike razlike između svjetla i mraka, poput 500 naspram 25 uM za Pseudomonas i 80 naspram 20 uM za epidemijsku MRSA, ali i poučne neuspjehe kod enterokoka i Candida s funkcionalnim efluksnim mehanizmima. Prenošenje tih nalaza u praksu zavisi jednako od dopremanja boje, fiziologije biofilma i kisika kao i od nominalne koncentracije boje. Kada su ti uslovi jasno navedeni, brojevi imaju značenje. Kada ih izostavite, brojevi ne znače ništa.