Metilensko plavilo, Nrf2 i mitohondrijska biogeneza: objašnjenje

U tekstovima o metilenskom plavilu često se pojavljuje jedna rečenica: ono aktivira Nrf2 i stvara nove mitohondrije. Ta rečenica zvuči kao jedna tvrdnja, ali sadrži dva različita koncepta, proučavana u različitim sistemima, uz različite vrste dokaza. Prvi je signalni put, senzor koji uključuje odbrambene gene. Drugi je program izgradnje, u kojem ćelija stvara više mitohondrijskog aparata. Signal može pokrenuti izgradnju, ali dokaz da se signal aktivirao nije isto što i dokaz da je izgradnja dovršena, a više građevinskog materijala nije isto što i bolja opskrba energijom. Ovaj članak razdvaja te tri stvari.

Koncept Nrf2: senzor, a ne štit

Nrf2 (nuklearni faktor povezan s eritroidnim faktorom 2, faktor 2) je transkripcijski faktor, protein čiji je zadatak da uključuje gene. U stanju mirovanja u citoplazmi ga zadržava senzorski protein Keap1, koji ga predaje ćelijskom aparatu za razgradnju radi neprekidnog uništavanja. Kada oksidansi ili elektrofili modificiraju reaktivne cisteine na proteinu Keap1, razgradnja prestaje. Novonastali Nrf2 se nakuplja, prelazi u jedro, udružuje se s malim proteinima Maf i veže se za sekvence DNK koje se nazivaju elementi antioksidativnog odgovora. To vezivanje uključuje niz odbrambenih gena.

Kanonski pokazatelji ovog puta su specifični. NQO1 (NAD(P)H kinon dehidrogenaza 1) i TrxR1 (tioredoksin reduktaza 1) spadaju među najpouzdanije ciljne gene Nrf2. HO-1 (hem oksigenaza-1) može se snažno inducirati, ali reagira i na druge regulatore. Enzimi poput SOD i katalaze dio su antioksidativnog aparata, ali njihove nivoe kontroliraju brojni transkripcijski faktori, pa porast SOD sam po sebi ne dokazuje da je uzrok bio Nrf2. Dokazi najbliži samom signalnom događaju jesu nakupljanje Nrf2 u jedru, aktivacija reporterskog sistema ARE ili indukcija kanonskih ciljnih gena koja nestaje kada se Nrf2 ukloni. Sve ostalo, niži nivoi oksidansa, bolje preživljavanje pod stresom, više glutationa, jeste nizvodni učinak koji mogu proizvesti brojni putevi.

Najraniji rezultat s metilenskim plavilom u ovoj priči nalazi se blizu tog kraja skale. Fibroblasti izloženi nanomolarnim koncentracijama metilenskog plavila pokazali su odgođenu senescenciju uz veći sadržaj kompleksa IV, veću potrošnju kisika i indukciju enzima faze 2, TrxR1 i NQO1, kako je opisano u studiji koja je prva povezala metilensko plavilo s poboljšanjem mitohondrijske funkcije i odgađanjem senescencije. TrxR1 i NQO1 upravo su oni kanonski ciljni geni Nrf2 koje pažljiv čitalac želi vidjeti. Ono što studija nije pokazala jeste sam signalni događaj: nije bilo mjerenja Nrf2 u jedru, reporterskog sistema ARE ni kontrolnog eksperimenta s isključenim genom Nrf2. Stoga je precizno tumačenje da metilensko plavilo u ovom sistemu inducira poznate ciljne gene Nrf2, što je u skladu s aktivacijom Nrf2, ali ne izdvaja Nrf2 kao uzrok. Indukcija ciljnog gena nalazi se jedan korak nizvodno od samog prekidača.

Koncept biogeneze: program s tri kontrolne tačke

Mitohondrijska biogeneza je program kojim ćelija povećava svoj mitohondrijski kapacitet. Njena udžbenička hijerarhija prolazi kroz tri kontrolne tačke. Prvo, koaktivator PGC-1alpha uključuje program. Drugo, nuklearni transkripcijski faktori (zbunjujuće, jedan se naziva NRF1, nuklearni respiratorni faktor 1, i drugačiji je protein od Nrf2) pokreću ekspresiju mitohondrijskih gena, uključujući TFAM, koji održava i replicira mitohondrijsku DNK. Treće, ćelija na kraju ima više mitohondrijskih genoma i više respiratornog aparata, što se može mjeriti brojem kopija mtDNK, aktivnošću citrat sintaze ili količinom i aktivnošću respiratornih kompleksa.

Svaka kontrolna tačka omogućava slabiju ili jaču tvrdnju u odnosu na prethodnu. Viši nivoi glasničke RNK za PGC-1alpha ili TFAM pokazuju da je zatraženo pokretanje programa, a ne da je on dovršen. Više mtDNK ili proteina kompleksa IV pokazuje da ima više materijala, ali isti obrazac mogu pokazati i preoblikovani mitohondriji. Bolja respiracija, veća potrošnja kisika ili veća aktivnost kompleksa pokazuju da se funkcija promijenila, ali funkcija se može poboljšati i bez stvaranja ijednog novog mitohondrija. Čvrsta tvrdnja o biogenezi objedinjuje sve troje: regulator, sadržaj i funkciju.

Nastavna studija na fibroblastima obuhvatila je većinu tog lanca. U ljudskim ćelijama IMR90 tretiranim metilenskim plavilom u koncentraciji od 100 nanomola, omjer NAD prema NADH prolazno je porastao unutar 15 minuta i vratio se na početnu vrijednost unutar jednog dana. Nakon tog prolaznog energetskog signala uslijedila je prolazna fosforilacija energetskog senzora AMPK, zatim indukcija PGC-1alpha i SURF1, proteina potrebnog za sastavljanje funkcionalnog kompleksa IV. Aktivnost kompleksa IV približno se udvostručila, nivoi ćelijskih oksidansa pali su za oko 28 posto, a telomeri su se sporije skraćivali. Cijeli slijed prikazan je u radu koji povezuje redoks aktivnost metilenskog plavila s AMPK i mitohondrijskom biogenezom.

Dva detalja u tom radu zaslužuju pažnju jer se takvi detalji obično izostavljaju. Prvo, obrazac aktivacije bio je važniji od samog njenog prisustva: metilensko plavilo prolazno je aktiviralo AMPK, dok ga je referentni lijek AICAR aktivirao hronično, a prolazni aktivator odgađao je senescenciju oko osam puta djelotvornije. Tvrdnja poput „metilensko plavilo aktivira AMPK” zato je nepotpuna; relevantna tvrdnja jeste da ono prolazno aktivira AMPK, a poređenje upućuje na to da hronična aktivacija nema isti učinak. Drugo, metilensko plavilo nije promijenilo ćelijski ciklus, čime se isključuje najjednostavnije alternativno objašnjenje: da su se ćelije samo sporije dijelile pa su zbog toga djelovale mlađe.

Istraživanja na miševima: ponašanje, genomi i namjerno paradoksalan okidač

Rad na ćelijskim kulturama proširila je na životinje grupa koja je proučavala miševe srednje dobi. Nakon 60 dana oralne primjene metilenskog plavila, tretirani miševi zadržali su više fizičke izdržljivosti i istraživačkog ponašanja te pokazali manje ponašanja nalik anksioznosti nego netretirani ostarjeli miševi. U moždanom tkivu ekspresija gena koju je starenje potisnulo, NRF1, TFAM, SOD2 i COX1, podjedinice kompleksa IV, vratila se prema nivoima kod odraslih jedinki, a broj kopija mtDNK porastao je. Ti rezultati, ponašanje zajedno s regulatorom i količinom genoma, opisani su u studiji na miševima srednje dobi o metilenskom plavilu i mitohondrijskoj biogenezi u mozgu.

Predloženi okidač je zanimljiv jer se suprotstavlja jednostavnoj priči da je metilensko plavilo antioksidans. Tretirani miševi pokazali su povećano stvaranje reaktivnih vrsta kisika u mitohondrijima mozga, konkretno vodikovog peroksida. Autori su predložili sljedeće objašnjenje: blagi peroksidni signal aktivira put Nrf2, koji zatim pokreće program biogeneze. U ovom modelu metilensko plavilo djeluje kao prooksidans u koraku pokretanja, a kao antioksidans u koraku krajnjeg ishoda. Farmakolozi taj obrazac nazivaju hormezom, pri kojoj mali stres izaziva odbrambeni odgovor veći od samog stresa. Da li taj porast peroksida zaista uzrokuje aktivaciju Nrf2 nije direktno ispitano; to je predložena veza, a ne izmjerena karika.

Prateća studija iste grupe podvrgnula je sigurnosni aspekt te pretpostavke zahtjevnim ispitivanjima. U izoliranim mitohondrijima mozga metilensko plavilo povećalo je proizvodnju vodikovog peroksida već pri koncentracijama od 50 nanomola, ali terapijske koncentracije nisu uzrokovale mjerljivo oštećenje mitohondrijske DNK. Tek pri 100 mikromola, daleko iznad terapijskih nivoa, odabrani fragmenti mtDNK pokazali su oštećenje, a kombinacija boje u koncentraciji od 20 mikromola i crvenog svjetla proizvela je singletni kisik koji je oštetio mtDNK u širokom obimu. To odgovara poznatom fotosenzibilizirajućem djelovanju boje, a ne njenom farmakološkom djelovanju bez svjetla. Prethodni tretman čak je zaštitio mitohondrije ventralnog srednjeg mozga od lezija mtDNK izazvanih rotenonom. Odgovor u zavisnosti od doze i kontrole genotoksičnosti detaljno su opisani u studiji o negenotoksičnom stvaranju peroksida pod djelovanjem metilenskog plavila.

Izmjereno naspram pretpostavljenog: čitanje dijagrama

Dijagram puteva u nastavku izrađen je za ovaj članak kako bi jasno prikazao razliku koju tekst naglašava. Okviri s punim rubovima predstavljaju korake koji imaju direktnu eksperimentalnu potporu u literaturi o metilenskom plavilu: redoks ciklus koji mijenja omjer NAD/NADH, prolaznu fosforilaciju AMPK, indukciju PGC-1alpha i SURF1, veću aktivnost kompleksa IV, indukciju NQO1 i TrxR1, obnovljenu ekspresiju gena biogeneze i broj kopija mtDNK u mozgu miševa te porast peroksida bez oštećenja mtDNK pri terapijskim dozama. Okviri s isprekidanim rubovima predstavljaju predložene veze: prepoznavanje peroksidnog signala putem Keap1, nakupljanje Nrf2 u jedru koje pokreće odbrambene gene i uzročnu strelicu od aktivacije Nrf2 do programa biogeneze. Ti isprekidani koraci su vjerovatni, u skladu su s podacima i pripadaju standardnoj udžbeničkoj biologiji, ali u ovim radovima nisu mjereni uz kontrole (Nrf2 u jedru, reporterski sistemi ARE, isključivanje gena Nrf2) koje bi opravdale njihov prikaz punim okvirima.

Kada je dijagram pred vama, postaju vidljive tri zabune. Prvo, NRF1 i Nrf2 su različiti proteini s gotovo identičnim nazivima; studija na miševima mjerila je nuklearni respiratorni faktor 1, regulator biogeneze, a ne antioksidativni transkripcijski faktor, pa njihovo poistovjećivanje svodi cijeli dijagram na jedan čvor. Drugo, ekspresija gena je početak priče, a ne njen kraj; obnovljeni nivoi glasničke RNK za TFAM ili COX1 potkrepljuju zahtjev za pokretanje biogeneze, dok su broj kopija mtDNK i aktivnost kompleksa IV dokazi da je taj zahtjev ispunjen. Treće, antioksidativni ishod ne dokazuje da se sve odvijalo putem Nrf2; pad oksidansa od 28 posto u fibroblastima i zaštita od rotenona kod miševa stvarni su nizvodni učinci, ali više puteva dovodi do njih.

Šta bi opravdalo zamjenu isprekidanog okvira punim

Eksperimenti koji nedostaju su standardni. Mjerenje proteina Nrf2 u jedru nakon izlaganja metilenskom plavilu, u vremenskim tačkama usklađenim s prolaznim signalom AMPK, ispitalo bi da li se oba ogranka zaista aktiviraju zajedno, kako tvrdi hipoteza o sinhroniziranoj aktivaciji. Reporterski sistem vođen elementom ARE potvrdio bi transkripcijsku aktivnost umjesto njenog izvođenja iz ciljnih gena. Ponavljanje mjerenja pokazatelja biogeneze uz smanjenu ekspresiju ili potpuno isključen gen Nrf2 direktno bi ispitalo uzročnu strelicu: ako se indukcija kompleksa IV i povećanje mtDNK održe bez Nrf2, predložena veza je pogrešna i ogranak AMPK sam ostvaruje učinak. U istraživanjima na životinjama, studija hronične primjene s istim trima kontrolnim tačkama, regulatorom, sadržajem i funkcijom, ispitala bi da li program ostaje aktivan ili se prilagođava. Do tada sinhronizirana aktivacija energetskih i odbrambenih puteva ostaje ono kako su je njeni autori opisali: mogući ključni faktor, a ne utvrđen mehanizam.

Čitaocima koji polaze od šire farmakologije može biti koristan dodatni kontekst: kako metilensko plavilo prenosi elektrone na mitohondrijskom nivou, šta još radi mitohondrijima i ćelijskoj energiji, gdje se nalazi o senescenciji uklapaju u istraživanja starenja, kako su tvrdnje o biogenezi povezane s kognitivnim učinkom i kakvi podaci o sigurnosti postavljaju granice svakoj raspravi o doziranju. Svaka od tih tema zaseban je koncept s vlastitim dokazima i svaka zaslužuje isto razdvajanje izmjerenog od pretpostavljenog koje je ovaj članak primijenio na Nrf2.