Metilensko plavilo i neurotransmiteri: serotonin, dopamin, GABA i acetilholin

Često se za metilensko plavilo kaže da istovremeno povećava serotonin, povećava dopamin, smiruje GABA-u i izoštrava djelovanje acetilholina. Ta rečenica četiri odvojena laboratorijska nalaza predstavlja kao jedno djelovanje u ljudskom organizmu. Radovi na kojima se zasniva mjerili su različite mete, u različitim preparatima, pri koncentracijama koje se razlikuju za približno hiljadu puta. Kada se mete razdvoje, slika postaje i zanimljivija i opreznija nego što to ta jedna rečenica dopušta.

Osnovna ideja je jednostavna. Molekula koja se veže za enzim u epruveti uradila je jednu stvar: vezala se za enzim u epruveti. Hoće li to promijeniti nivo neurotransmitera u živom mozgu zavisi od koncentracije koja dospije u tkivo, od hemijskog oblika molekule pri dolasku i od svih drugih djelovanja te molekule pri istoj koncentraciji. U svakom odjeljku u nastavku ta tri pitanja ostaju povezana s nalazom na koji se odnose.

Serotonin: dvije mete, dvije koncentracije

Od četiri sistema, za serotonin postoje najjači dokazi, a oni potječu od dvije različite molekularne mete koje ne treba objedinjavati.

Prva meta je monoamin oksidaza tipa A, mitohondrijski enzim koji razgrađuje serotonin. Metilensko plavilo inhibira pročišćenu ljudsku MAO-A kao inhibitor s čvrstim vezivanjem, uz Ki od približno 27 nanomolara, dok su za djelovanje na MAO-B potrebne mnogo veće koncentracije, kako je pokazano u kinetičkoj studiji koja je povezala boju sa serotoninskom toksičnošću. Povezana istraživanja utvrdila su istu selektivnost u tkivu epifize štakora, gdje je blokada MAO-A povećala količinu indola izvedenih iz serotonina, smanjila količinu serotoninskog metabolita 5-HIAA i promijenila refleks ispravljanja povezan sa serotoninom kod žaba, što je opisano u studiji redoks boja i indola epifize. Dva različita preparata, isti smjer: manje razgradnje, više zadržanog serotonina tamo gdje bi ga enzim uklonio.

Druga meta je sam serotoninski transporter. U ćelijama koje eksprimiraju ljudski transporter, metilensko plavilo smanjilo je unos i fluorescentnog supstrata i obilježenog serotonina, uz IC50 od oko 1.4 mikromolara, te potisnulo struje izazvane serotoninom u snimanjima metodom patch-clamp, prema direktnoj karakterizaciji djelovanja metilenskog plavila na SERT. Autori su provjerili očigledna alternativna objašnjenja i utvrdili da djelovanje ne zavisi od signalizacije putem cGMP-a, promjena kalcija ni ekspresije transportera na površini ćelije.

Obratite pažnju na razliku između te dvije vrijednosti. Inhibicija MAO-A odvija se pri nanomolarnim koncentracijama. Za inhibiciju transportera potrebno je približno pedeset puta više boje. Niska izloženost koja u potpunosti djeluje na enzim može jedva utjecati na transporter. Svako ko ovo objedini u jednu tvrdnju o serotoninu svodi dva različita raspona doza na jedan.

Da li je bilo koja od ovih meta važna kod osobe koja uzima druge serotonergičke lijekove pitanje je primjene lijekova i pripada vodiču za interakcije lijekova. Ovaj članak prikazuje mete; ta stranica sadrži kliničke savjete.

Dopamin: najslabiji direktni dokazi

Kod dopamina je za tačan prikaz potrebna najveća suzdržanost. Ne postoji dobro potvrđena studija koja pokazuje da metilensko plavilo blokira dopaminski transporter ili se direktno veže za dopaminske receptore. Često citirani IC50 transportera od 1.4 mikromolara odnosi se na serotoninski transporter, a ne na DAT, i nikada ga ne treba pripisivati drugom transporteru.

Postojeći dokazi su, umjesto toga, indirektni. Budući da enzimi MAO metaboliziraju i dopamin, inhibicija MAO-a čuva dopamin zajedno sa serotoninom i noradrenalinom. U mitohondrijskim preparatima metilensko plavilo blokiralo je pretvaranje neurotoksina MPTP u njegov proizvod toksičan za dopaminergičke neurone, posredovano MAO-B-om, uz potentnost uporedivu s deprenilom, lijekom za Parkinsonovu bolest, kako opisuju studija bioaktivacije MPTP-a i povezani radovi o MAO-B-u. Istraživanja na životinjama dodaju djelimične nalaze: približno trostruko povećanje bazalnog oslobađanja dopamina iz rezova strijatuma štakora pri 10 mikromolara, istraženo u kontekstu signalizacije dušikovim oksidom, a ne blokade transportera, te neujednačene rezultate po regijama nakon sistemske primjene, pri čemu su neke studije utvrdile porast serotonina i noradrenalina, dok se dopamin jedva promijenio.

Dakle, dokazi o dopaminu postoje, ali su posredni. Djelovanje se odvija preko enzima koji istovremeno obrađuje nekoliko monoamina, a ne preko mete specifične za dopamin. Svaka tvrdnja da metilensko plavilo povećava dopamin kod ljudi preskače korak u kojem bi to zapravo bilo pokazano.

GABA: blokiranje kočnice u veznom džepu

Nalaz o GABA-i je precizan i suprotan uobičajenoj reputaciji ove boje. U ćelijama koje eksprimiraju ljudske GABA-A receptore, metilensko plavilo inhibiralo je struje izazvane GABA-om počevši od oko 3 mikromolara, uz IC50 od približno 31 mikromolara za uobičajenu konfiguraciju alpha1-beta2-gamma2, u elektrofiziološkoj studiji koja je utvrdila mjesto djelovanja.

Utvrđivanje mjesta djelovanja vrijedan je dio nalaza. Mutacije na mjestu vezivanja pikrotoksina nisu promijenile inhibiciju, a mjesta vezivanja benzodiazepina i cinka isključena su poređenjem podjedinica. Nasuprot tome, mutacije na dva aminokiselinska ostatka za koje je poznato da čine sam vezni džep GABA-e znatno su smanjile blokadu. To djelovanje označava kao kompetitivni antagonizam na mjestu vezivanja agonista, a ne kao alosteričku modulaciju na drugom mjestu. Djelovanje je zadržano u različitim kombinacijama sinaptičkih i ekstrasinaptičkih podjedinica i brzo je nestajalo nakon ispiranja.

To stvara stvarnu napetost koju treba jasno navesti. Molekula koja se istražuje radi podrške pamćenju ujedno potiskuje brzu inhibitornu transmisiju u laboratorijskoj posudi. Hoće li se to potiskivanje javiti u živom mozgu zavisi od lokalne koncentracije, a 31 mikromolar je visoka vrijednost u odnosu na većinu sistemskih izloženosti, čime se bavi završni odjeljak. Sama ta napetost predstavlja nalaz; za njeno razrješenje bili bi potrebni eksperimenti koje niko nije proveo.

Acetilholin: dvije mete sa suprotnim djelovanjem

Za acetilholin postoje dva nalaza koja upućuju u suprotnim smjerovima, zbog čega se moraju prikazati odvojeno.

S jedne strane, metilensko plavilo inhibira enzime koji uklanjaju acetilholin. Acetilholinesteraza iz crvenih krvnih ćelija krave kompetitivno je inhibirana pri oko 0.57 mikromolara, enzim goveđeg porijekla pri približno 0.42 mikromolara, a aktivnost esteraze u ljudskoj plazmi pri približno 1.1 mikromolara. Butirilholinesteraza je inhibirana u rasponu od približno 0.4 do 5.3 mikromolara, zavisno od vrste i preparata, kako je sažeto u pregledu djelovanja metilenskog plavila u nervnom sistemu. Usporavanje uklanjanja ostavlja više neurotransmitera u sinapsi, što je ista logika na kojoj se zasniva nekoliko odobrenih lijekova za Alzheimerovu bolest.

Ali ta hemija ima svoj uslov. Oksidirani plavi oblik inhibira enzim; reducirani bezbojni oblik to ne čini, a pri dugim inkubacijama koje omogućavaju redukciju boje bilježi se slabija inhibicija samo iz tog razloga. Svaka vrijednost iz testa holinesteraze nosi jednu nevidljivu varijablu: koliki je dio boje još bio plav u trenutku mjerenja.

S druge strane, metilensko plavilo blokira nikotinski receptor alpha7, jedan od receptora na koje acetilholin djeluje. Ljudski alpha7 receptori eksprimirani u oocitama žabe inhibirani su uz IC50 od približno 3.4 mikromolara putem nekompetitivnog antagonizma nezavisnog od napona, koji nije promijenio potentnost agonista, a 3 mikromolara potpuno je ukinulo sinaptičke odgovore izazvane holinom u rezovima hipokampusa štakora, kako navodi studija receptora alpha7. Dakle, pri sličnim niskim mikromolarnim koncentracijama boja istovremeno čuva neurotransmiter i slabi djelovanje jednog od njegovih receptora. Ukupan učinak na holinergičku signalizaciju ne može se zaključiti ni iz jednog od ta dva nalaza zasebno. Ta nejasnoća povezana je sa širom literaturom o Alzheimerovoj bolesti i s povezanom raspravom o istraživanjima kognicije i bolesti, ali ovdje ostaje nerazriješena.

Poređenje na jednom mjestu

Najosjetljiviju i najmanje osjetljivu metu razdvajaju tri reda veličine. Taj raspon sažima članak u jednoj tabeli.

Dostižu li ove koncentracije mozak?

Vrijednost iz epruvete ne znači ništa bez vrijednosti izloženosti uz nju. Nakon intravenskog bolusa od približno 1.4 mg po kg zabilježeni su prosječni nivoi u ljudskoj plazmi od oko 5 mikromolara, dok je oralna doza od 100 mg dovela do nivoa u punoj krvi od približno 0.08 mikromolara u istoj literaturi. Istraživanja raspodjele kod štakora nalaze nivoe u mozgu približno deset do dvadeset puta veće od nivoa u cirkulaciji, iako je to ukupna boja u homogeniziranom tkivu, a ne slobodna oksidirana boja u sinapsi. Vezivanje za proteine plazme od približno 94 posto, zajedno s raspodjelom u krvne ćelije, dodatno smanjuje slobodnu frakciju.

U poređenju s tabelom, obrazac je postepen, a ne binaran. Inhibicija MAO-A javlja se daleko ispod tipičnih intravenskih izloženosti i farmakološki je vjerovatna kad god se boja primjenjuje tim putem. Djelovanja na holinesterazu i alpha7 nalaze se u niskom mikromolarnom rasponu s kojim se preklapaju vršne intravenske koncentracije, ali koji uobičajene oralne doze možda ne dosežu. IC50 GABA-A od 31 mikromolara nalazi se iznad većine vjerovatnih sistemskih izloženosti, što tu blokadu čini najtežom za pripisivanje djelovanju u cjelokupnom ljudskom organizmu. Svaki red ovog poređenja zahtijeva istu ogradu: relevantna je koncentracija slobodne, oksidirane, izvanćelijske boje na meti, a tu količinu nijedan uzorak krvi ne mjeri direktno.

Šta ne treba zaključiti

Nijedan red u tabeli ne dokazuje da metilensko plavilo predvidljivo povećava ili smanjuje bilo koji neurotransmiter kod osobe. Inhibicija enzima u pročišćenom preparatu, blokada transportera u ćelijskoj liniji i antagonizam receptora u rezu tkiva predstavljaju zasebne kontrolirane korake udaljene od stvarnih zbivanja u sinapsi, a odjeljak o holinergičkom djelovanju pokazuje kako se dva potvrđena nalaza mogu međusobno suprotstaviti i ostaviti neizvjestan zaključak. Ovu stranicu treba odgovorno koristiti kao prikaz meta za koje je pokazano da molekula na njih djeluje, uz označenu jačinu djelovanja, kako bi rasprava o mehanizmima ostala zasnovana na onome što je zaista izmjereno. Za interakcije tih meta s propisanim lijekovima, vodič za interakcije je stranica koja obrađuje tu temu, uz dodatni kontekst u osnovama farmakologije i pratećem objašnjenju mehanizama.