Metilensko plavilo i masna jetra: šta su pokazala eksperimentalna istraživanja

Masna jetra je jedan naziv za nekoliko različitih problema. Kod jedne osobe uzrok je dugotrajna prekomjerna konzumacija alkohola. Kod druge je to prekomjeran unos hranjivih tvari uz inzulinsku rezistenciju i povećan dotok masti u jetru. Pod mikroskopom se u oba slučaja može vidjeti jednostavno nakupljanje masti, ali početni uzroci se razlikuju. Ta razlika određuje šta pojedini eksperiment može dokazati.

Literatura o metilenskom plavilu i masnoj jetri je malobrojna i, kada je riječ o ovom pitanju, u potpunosti pretklinička. Najčešće se navode tri istraživanja na štakorima i miševima, a njihovi rezultati ne upućuju svi u istom smjeru. U jednom istraživanju s etanolom u ishrani korigovana je promjena redoks stanja, ali je količina masti u jetri ostala nepromijenjena. U jednom istraživanju s ishranom bogatom mastima smanjena je količina masti u jetri uz promjenu signalizacije. U jednom istraživanju na zdravim životinjama utvrđeni su suprotni rezultati lipidne peroksidacije u jetri i bubrezima. Posmatrana zajedno, ova istraživanja pokazuju zašto tri ishoda moraju ostati odvojena: promjena redoks stanja, aktivacija signalizacije i nakupljanje masti u tkivu.

Tri ishoda koja je lako pomiješati

Redoks mjera opisuje prijenos elektrona. Omjer NAD+ prema NADH u jetri pokazuje je li ćelijsko okruženje relativno oksidirano ili reducirano. Oksidacija etanola pretvara NAD+ u NADH, pa hronična konzumacija alkohola snižava taj omjer. Boja koja prihvata elektrone može ga ponovo povećati. To je hemija, a ne dokaz manje količine pohranjene masti.

Mjera signalizacije opisuje regulaciju. SIRT1 je regulatorni enzim zavisan od NAD+ koji modificira proteine uključene u funkciju mitohondrija i metabolizam lipida. AMPK djeluje kao senzor niskog energetskog statusa koji, kada se aktivira, podstiče oksidaciju goriva i ograničava sintezu lipida. Kada rad izvještava o aktivaciji SIRT1 u jetri djelovanjem metilenskog plavila, on izvještava o promjeni regulacije. Još ne izvještava o ishodu kod pacijenta.

Histološka ili biohemijska mjera opisuje samu jetru. Uobičajeni primjeri su sadržaj triglicerida po gramu tkiva, bojenje neutralnih masti bojom Oil Red O, procjena baloniranja ćelija i oštećenja bojenjem hematoksilinom i eozinom te aktivnost ALT u plazmi. Samo ova treća kategorija odgovara na pitanje je li se steatoza jetre poboljšala uz metilensko plavilo u tom eksperimentu.

Razdvajanje ovih kategorija sprečava najčešće pogrešno tumačenje: povoljan redoks rezultat ili rezultat signalizacije ne znači manje zamašćenje jetre.

Model s etanolom: redoks stanje korigovano, mast nepromijenjena

Najjasniji negativni nalaz potiče iz istraživanja s hroničnim unosom etanola kroz ishranu kod mužjaka Wistar štakora. Životinje su primale etanol kao dio tečne ishrane, uz povećanje njegovog udjela do 36 posto ukupne energije, dok su kontrolne životinje s uparenim unosom hrane dobijale glukozu umjesto energije iz etanola. Jedna grupa koja je primala etanol i jedna kontrolna grupa dobijale su i metilensko plavilo u količini od 130 mg po litru hrane, približno 42 mg po kg dnevno, od 5. do 30. dana.

Redoks stanje procijenjeno je pomoću standardnih parova metabolita: omjera laktata prema piruvatu za citosol i omjera 3-hidroksibutirata prema acetoacetatu za mitohondrije. U ranoj fazi ishrane s visokom dozom etanola, grupe koje su primale etanol pokazale su velike promjene: citosolni omjer NAD+ prema NADH smanjen je za približno 62 posto, a mitohondrijski za približno 71 posto, uz povišen glicerol 3-fosfat. Metilensko plavilo je uglavnom poništilo te promjene i vratilo glicerol 3-fosfat blizu kontrolnih vrijednosti, bez promjene unosa etanola, prirasta tjelesne mase ili koncentracije etanola u serumu.

Nalazi masti u jetri pokazali su drugačiju sliku. Na 12. dan, prije znatnog nakupljanja masti, sadržaj triglicerida nije se razlikovao među grupama. Na 27. dan, grupe koje su primale etanol imale su velika povećanja triglicerida bez obzira na metilensko plavilo. Na 30. dan, ukupni lipidi porasli su za približno 89 posto, a trigliceridi za približno 196 posto kod životinja hranjenih etanolom, ponovo bez utjecaja boje. Centrilobularna masna infiltracija izgledala je isto sa i bez tretmana. Autori su zaključili da promjena redoks stanja izazvana etanolom nije primarni uzrok masne jetre nakon dugotrajne ishrane u ovom modelu. Ovdje pomaže razumijevanje načina na koji se nalazi na životinjama i ćelijama mogu prenijeti na procjenu rizika kod ljudi: mehanizam može biti stvaran, a ipak ne određivati ishod.

Ovo je istraživanje koje treba navesti kada neko tvrdi da svaka korekcija redoks stanja mora ukloniti mast iz jetre. U ovom eksperimentalnom dizajnu to se nije dogodilo.

Metabolički model: signalizacija uz manje masti, kod miševa

Drugačiju sliku daje istraživanje na hepatocitima i miševima hranjenim ishranom bogatom mastima, usmjereno na SIRT1 i AMPK. U ćelijama HepG2, ćelijama AML-12 i primarnim hepatocitima štakora, metilensko plavilo povećalo je omjer NAD+ prema NADH, povećalo količinu proteina SIRT1, smanjilo acetilaciju regulatora PGC-1alpha, povećalo sadržaj mitohondrijske DNK i potrošnju kisika te aktiviralo AMPK uz posljedična povećanja CPT-1 i PPARalpha. Kada je ekspresija SIRT1 smanjena, aktivacija AMPK je izostala, što povezuje ovaj slijed sa SIRT1 u tom ćelijskom sistemu. Boja je također suzbila lipogene signale izazvane agonistom LXR T0901317 i izlaganjem palmitatu, uključujući indukciju SREBP-1c, FAS i ACC.

U životinjskom dijelu korišteni su mužjaci miševa C57BL/6 hranjeni ishranom sa 60 posto masti tokom 8 sedmica. Metilensko plavilo davano je oralno četiri puta sedmično tokom posljednje 4 sedmice u dozi od 3 ili 10 mg po kg dnevno. Tretirani miševi pokazali su manje bojenja bojom Oil Red O, niži sadržaj triglicerida u jetri, manje baloniranja ćelija i masne degeneracije na histološkom pregledu te niži ALT u plazmi nego netretirani miševi na ishrani bogatoj mastima. Farmakokinetički dio istog rada utvrdio je oralnu bioraspoloživost od približno 31 do 35 posto, uz gotovo potpunu crijevnu apsorpciju, ali značajan metabolizam, te najviši omjer koncentracije u tkivu prema koncentraciji u plazmi u jetri. To čini učinak na jetru barem mogućim s obzirom na raspodjelu.

To je stvaran signal smanjenja steatoze, ali njegova ograničenja su velika. Riječ je o kratkom eksperimentu na miševima sa 9 do 10 životinja po grupi, jednom vrstom ishrane, dvije doze i četiri sedmice tretmana. Ispituje metaboličku steatozu i obilježja steatohepatitisa, a ne bolest povezanu s alkoholom, i ne ispituje cirozu, povlačenje fibroze niti bilo koji ishod kod ljudi. Uloga mitohondrijskih i redoks mjerenja u tumačenju takvih rezultata jeste da ih označe kao podršku hipotezi, a ne kao dozu ili protokol.

Presjek stanja zdravog tkiva: ista doza, suprotni nalazi u organima

Treće istraživanje često se uključuje u tvrdnje o jetri za koje nije relevantno. U 30-dnevnom eksperimentu na zdravim ženkama Wistar štakora, pet životinja primalo je 1 mM metilenskog plavila u vodi za piće, a pet je služilo kao kontrola. Superoksid dismutaza, katalaza i reducirani glutation nisu se promijenili u jetri ili bubrezima. Lipidna peroksidacija blago je porasla u jetri, a smanjila se u bubrezima. ALT i kreatinin u serumu su se smanjili, bez promjene azota ureje u krvi.

Tačno tumačenje jeste specifičnost učinka za pojedino tkivo kod zdravih životinja, a ne liječenje bolesti. Ista izloženost prema jednom markeru djelovala je blago prooksidativno u jetri, a blago zaštitno prema istom markeru u bubrezima, dok su standardni antioksidativni odbrambeni mehanizmi ostali nepromijenjeni. Sa pet životinja po grupi i bez modela bolesti, ovaj rad upozorava na neopravdanost nazivanja metilenskog plavila općim antioksidansom za jetru. Također pokazuje zašto promjene jetrenih enzima zahtijevaju definisan kontekst bolesti prije nego što se mogu protumačiti kao poboljšanje.

Poređenje tri eksperimenta na jetri

Tabela jasno pokazuje glavnu poruku. Slična plava boja, različita biologija. Istraživanje s etanolom razdvaja uspješnu korekciju redoks stanja od izostanka smanjenja masti. Istraživanje s ishranom povezuje signalizaciju i smanjenje masti u jednom modelu. Istraživanje na zdravim životinjama pokazuje da se redoks markeri mogu mijenjati u suprotnim smjerovima u različitim organima.

Zašto iz ovoga ne proizlazi tvrdnja o liječenju

Nijedno od ovih istraživanja nije uključivalo ljude s masnom jetrom. Doze, putevi primjene i trajanja razlikuju se među radovima i ne mogu se pretvoriti u režim primjene za ljude jednostavnim preračunavanjem. Male grupe, posebno tri životinje po vremenskoj tački redoks mjerenja u radu s etanolom i pet po grupi u radu na zdravim životinjama, ostavljaju znatnu neizvjesnost. Spol, soj, sastav ishrane i vrijeme početka tretmana u odnosu na oštećenje također se razlikuju. Osim toga, dva modela bolesti predstavljaju različite početne uzroke, pa pozitivan rezultat s ishranom ne može poništiti negativan rezultat s etanolom, niti obrnuto.

Za svakoga s dijagnosticiranom bolešću jetre, ove nalaze prvenstveno treba čitati kao razlog za oprez, a ne kao osnovu za liječenje. Pregled mjera opreza za bubrege i jetru pri upotrebi metilenskog plavila objašnjava zašto oštećenje funkcije organa mijenja pitanja sigurnosti čak i kada rezultati rada na životinjama izgledaju povoljno. Ljekaru predočite dijagnozu, nedavne laboratorijske nalaze, tačan proizvod i put primjene te potpun spisak lijekova i pitajte koji dokazi podržavaju primjenu tog proizvoda u tu svrhu kod osobe s tim stepenom oštećenja funkcije.

Zaključak: metilensko plavilo promijenilo je redoks stanje jetre u jednom modelu s etanolom bez smanjenja pohranjene masti, aktiviralo je SIRT1 i AMPK uz smanjenje masti u jednom metaboličkom modelu na miševima te pokazalo redoks učinke specifične za pojedine organe kod zdravih štakora. To je skup smjernica za istraživanje, a ne utvrđen način liječenja masne jetre.