Zašto se metilensko plavilo koristi za kontrabojenje pri bojenju acidorezistentnih bakterija

Tehničar pregledava razmaz sputuma nakon cijelog postupka bojenja. Crveni štapići ističu se na plavom polju, a u izvještaju se navodi da su uočeni acidorezistentni bacili. Sljedećeg dana drugi preparat pokazuje jednolično plavo polje bez crvenih štapića i prijavljuje se kao negativan na tuberkulozu. Jedan od ovih izvještaja tvrdi više nego što preparat može potkrijepiti, i to nije prvi.

Zabuna je konceptualna. Tehničar je plavu boju smatrao dijelom hemijskog procesa otkrivanja, kao da metilensko plavilo pomaže u pronalaženju mikobakterija. Ne pomaže. Do trenutka kada metilensko plavilo dođe u dodir s preparatom, test je već završen. Boja samo boji pozadinu kako bi rezultat bio čitljiv. Ovaj članak objašnjava svrhu metilenskog plavila pri bojenju acidorezistentnih bakterija, zašto je ono plavo, a ne neke druge boje, i koje zaključke dopušta crvena boja na plavoj pozadini.

Kratak odgovor

Bojenje acidorezistentnih bakterija diferencijalni je test zasnovan na tri ideje. Karbol-fuksin, primarna boja, prisilno se unosi u svaku ćeliju, uključujući mikobakterije s voštanim omotačem. Kiseli alkohol, sredstvo za obezbojavanje, uklanja crvenu boju iz običnih ćelija, ali je ne uspijeva izvući iz acidorezistentnih. Metilensko plavilo, kontrastna boja, zatim boji sve iz čega je sredstvo za obezbojavanje uklonilo boju, pa neacidorezistentne ćelije, ćelije domaćina i detritus izgledaju plavo, dok acidorezistentni bacili ostaju crveni. Kontrabojenje daje kontrast. Ono nema nikakvu ulogu u hemiji koja ćeliju čini acidorezistentnom.

Šta radi svaki korak

Dijagram ispod prikazuje podjelu uloga. Čitajte ga slijeva nadesno kao postupak, a donju traku kao podsjetnik da svaka grupa metoda bojenja odgovara na drugačije pitanje.

Prodiranje dolazi prvo. Mikobakterije odolijevaju običnim vodenim bojama jer je njihov omotač izrazito hidrofoban, pa protokol prisilno omogućava ulazak boje. U metodi po Ziehl-Neelsenu zagrijavanje do pojave pare potiskuje karbol-fuksin koji sadrži fenol kroz voštani zid. U hladnoj metodi po Kinyounu toplota se zamjenjuje znatno jačom formulacijom primarne boje, a neke modificirane varijante bez zagrijavanja dodaju površinski aktivne tvari. Protokoli Američkog društva za mikrobiologiju za bojenje acidorezistentnih bakterija dokumentuju obje formulacije uporedo, a razlika u koncentraciji je upečatljiva: približno 0.3 g baznog fuksina na 100 mL za metodu sa zagrijavanjem naspram oko 4 g za hladnu metodu.

Diferencijacija dolazi druga. Kiseli alkohol, obično 3 mL koncentrirane hlorovodonične kiseline u 97 mL 95-postotnog etanola, ispire crvenu boju iz svake ćelije čiji zid ne pruža posebnu otpornost. Ćelije s očuvanim mikobakterijskim lipidnim omotačem zadržavaju boju. To je korak od kojeg zavisi cijela metoda i korak najosjetljiviji na tehniku izvođenja, kako je objašnjeno u nastavku.

Kontrast dolazi posljednji. Preparat sada sadrži crvene acidorezistentne ćelije na gotovo bezbojnoj pozadini ćelija iz kojih je uklonjena boja. Metilensko plavilo u koncentraciji od 0.3 posto w/v vraća vidljivost toj pozadini bojom koja se maksimalno razlikuje od crvene. Kontrabojenje je kratko, obično 20 do 30 sekundi u metodi sa zagrijavanjem i do nekoliko minuta u nekim varijantama hladne metode, a trajanje zavisi od protokola, a ne od svojstva same boje.

Zašto ova boja i zašto plava

Metilensko plavilo je kationska bazna boja, što znači da njegov obojeni ion nosi pozitivan naboj i veže se za negativno nabijene površine obezbojenih bakterija, ćelija domaćina i detritusa. OpenStax Microbiology opisuje ovu logiku naboja kao opći princip djelovanja baznih boja. Međutim, metilensko plavilo ovdje nije hemijski jedinstveno. Kristal-violet i safranin također su bazne boje. Izbor je optički, a ne hemijski.

Crvenim štapićima potrebna je pozadina kontrastne nijanse, a plava se suprotstavlja crvenoj na način koji je najkorisniji za mikroskopiju u svijetlom polju. Safranin bi bio loša kontrastna boja jer je njegova završna ružičastocrvena nijansa previše bliska zadržanom karbol-fuksinu, čime se gubi upravo ona razlika koju je postupak stvorio. Kristal-violet dao bi tamnoljubičastu pozadinu koja bi odvlačila pažnju od tankih crvenih bacila. Najjači dokaz da je zadatak kontrast, a ne hemija, jeste zamjena: zelene kontrastne boje poput malahitnog zelenila i briljantnog zelenila koriste se u nekim veterinarskim i modificiranim protokolima, a test i dalje djeluje jer svaka jasno različita nijansa obavlja isti posao.

Iz toga slijede dvije praktične posljedice. Prvo, standardna receptura ne propisuje podešavanje pH; nemojte ovaj obični vodeni rastvor od 0.3 posto miješati s alkalnim formulacijama poput Loefflerovog metilenskog plavila, koje pripadaju drugačijem konceptu bojenja. Drugo, pretjerivanje šteti. Histološka literatura izričito upozorava da pretjerano intenzivna plava pozadina može prikriti malobrojne bacile, pa držanje preparata prekrivenog bojom duže nego što protokol dopušta smanjuje čitljivost bez ikakve koristi.

Hemija zida koja omogućava test

Razlog zbog kojeg kiseli alkohol pravi razliku leži u mikobakterijskom omotaču. Njegovu strukturnu jezgru čini kompleks mikolil-arabinogalaktan-peptidoglikan: peptidoglikan povezan s arabinogalaktanom čiji vanjski krajevi nose mikolne kiseline s vrlo dugim lancima, stvarajući vanjsku mikomembranu bogatu lipidima i izrazito niske propusnosti. Pregled vanjske membrane mikobakterija detaljno opisuje ovu građu. Barijera djeluje u oba smjera. Odupire se ulasku boje, zbog čega prodiranje zahtijeva toplotu ili pojačanu primarnu boju, a odupire se i izvlačenju boje, zbog čega kiseli alkohol ne uspijeva ukloniti karbol-fuksin kada je već unutra. Obične bakterije nemaju ovaj omotač i gube boju. Acidorezistentnost je zato najbolje razumjeti kao pojavu povezanu s lipidnom barijerom, a ne kao hemijsko vezivanje fuksina za mikolnu kiselinu.

Ova hemija objašnjava i čestu nedoumicu: mikobakterije se metodom po Gramu boje slabo i nepredvidivo, ponekad se pojavljujući kao blijedi zrnasti oblici ili neobojene sjenke. Njihov hidrofobni zid ograničava prodiranje kristal-violeta. Bojenje acidorezistentnih bakterija nije modificirano bojenje po Gramu. To je drugačiji diferencijalni princip zasnovan na drugačijem svojstvu zida, kao što poređenje jednostavnog bojenja i bojenja po Gramu pokazuje za druge dvije metode.

Tri metode, tri pitanja

Za širu grupu metoda bojenja bakterija jednom bojom pogledajte atlas mikroskopskog bojenja.

Šta crveno na plavom ne može dokazati

Crveni štapići znače da su organizmi zadržali karbol-fuksin tokom djelovanja kiselog alkohola. Taj nalaz je u skladu s Mycobacterium tuberculosis, ali CDC-ove smjernice za dijagnostiku tuberkuloze izričito navode da su i druge mikobakterije acidorezistentne, pa su za identifikaciju vrste potrebni uzgoj u kulturi i testiranje nukleinskih kiselina, a ne boja.

Greške u tehnici najčešće se javljaju oko dva ispiranja. Nedovoljno obezbojavanje ostavlja materijal u pozadini crvenim i pogoduje lažno pozitivnim očitanjima. Pretjerano obezbojavanje uklanja slabo zadržanu primarnu boju i doprinosi lažno negativnim rezultatima. Preintenzivno kontrabojenje skriva malobrojne bacile u plavilu. Debeli razmazi, istaloženi reagensi i kontaminirana voda za ispiranje dodaju vlastite artefakte.

Osjetljivost je ograničena količinom organizama bez obzira na to koliko je tehnika besprijekorna. Konvencionalna mikroskopija razmaza zahtijeva približno 5,000 do 10,000 bacila po mililitru sputuma, a stariji CDC-ovi pregledi dokaza navodili su osjetljivost razmaza od oko 45 do 80 posto među plućnim slučajevima potvrđenim kulturom. Negativan razmaz stoga nikada ne isključuje tuberkulozu. Trenutne CDC-ove smjernice zadržavaju kulturu uz svaki razmaz i preporučuju test amplifikacije nukleinskih kiselina na najmanje jednom respiratornom uzorku kada se razmatra plućna tuberkuloza i kada bi rezultat promijenio postupanje.

Praktični rad mora slijediti odobrene protokole

Edukativni opisi, uključujući ovaj članak, ne daju ovlaštenje za klinički rad. Za praktični laboratorijski rad slijedite validirani standardni operativni postupak laboratorije, usklađen s važećim dokumentima CDC-a, APHL-a ili CLSI-ja; CDC-ov referentni dokument o bojenju acidorezistentnih bakterija pohranjen u arhivi Stacks pokazuje kako takvi postupci propisuju reagense i očitavanje rezultata. Rad s uzorcima za tuberkulozu zahtijeva mjere biološke zaštite: razmazi se pripremaju u kabinetu za biološku sigurnost jer priprema stvara aerosole i prskanje, a CDC-ove smjernice za laboratorijsku sigurnost navode da čak i toplotno fiksirani razmazi mogu sadržavati žive bacile tuberkuloze i da se njima i dalje mora rukovati kao kontaminiranim materijalom. Zapis u CDC-ovoj biblioteci slika javnog zdravlja o razmazu obojenom karbol-fuksinom i metilenskim plavilom, pregledanom na M. leprae koristan je podsjetnik na primjenu metode izvan tuberkuloze: isti kontrast crvenog na plavom služi svuda gdje se traže acidorezistentni organizmi, a pažljivo utvrđen negativan nalaz i sam je rezultat vrijedan bilježenja.

Očitavanje gotovog preparata

Kontrabojenje opravdava svoju ulogu tokom početnog pregleda. Mikroskopista koji pregledava preparat pri malom uvećanju prvo koristi plavu pozadinu za procjenu kvaliteta razmaza: ravnomjernu raspodjelu ćelija, očuvane ćelije domaćina za fokusiranje i odsustvo obilnog taloga. Crveni kandidati zatim privlače pogled upravo zato što ništa drugo na preparatu nije crveno. Potvrda se obavlja uz uljnu imerziju, gdje pravi bacili pokazuju očekivane tanke, ponekad blago zakrivljene ili zrnaste štapiće, a ne jednolične ostatke boje.

Bojenje pozadine određuje i formulaciju izvještaja. Za preparat s crvenim bacilima navodi se da su uočeni acidorezistentni bacili, često uz semikvantitativnu ocjenu prema laboratorijskoj skali. Za preparat bez crvenih organizama navodi se da nisu uočeni acidorezistentni bacili, nikada da je negativan na tuberkulozu. Razlika je važna jer plavo polje dokazuje da je bojenje uspjelo, da su ćelije primile kontrastnu boju i da su optički uslovi bili odgovarajući, ali ne govori ništa o organizmima ispod granice detekcije. Prazno plavo polje valjan je rezultat o preparatu, a ne zaključak o pacijentu.

Zapamtite podjelu uloga i izvještaji će se pisati sami. Karbol-fuksin otkriva kandidate. Kiseli alkohol provodi test. Metilensko plavilo samo čini odgovor čitljivim: crveno je zadržalo boju uprkos kiselini, plavo ju je izgubilo. Sve ostalo, vrsta, količina i kliničko značenje, proizlazi iz rada izvan samog preparata.