Metilensko plavilo i izlaganje svjetlosti: talasna dužina, iradijansa i geometrija tretmana

Dva rada navode izlaganje metilenskog plavila svjetlosti od 10 J po kvadratnom cm. U jednom to ubija bakterije. U drugom ne proizvodi nikakav mjerljiv učinak. Čitalac koji poredi samo dozu zaključuje da je ova oblast nedosljedna. Oblast je dosljedna. Doza nikada nije predstavljala cijelo izlaganje.

Izlaganje svjetlosti čini mali sistem parametara koji djeluju zajedno: talasna dužina, iradijansa, trajanje, rezultirajuća fluenca, dostupnost kisika, koncentracija bojila i stanje njegove agregacije, vremenski razmak između primjene bojila i svjetlosti te optički put kojim svjetlost zaista prolazi kroz uzorak. Promijenite jedan od njih i mijenja se fotohemija. Ovaj članak razmatra svaki parametar, a zatim razlikuje blisku infracrvenu fotobiomodulaciju od direktne fotoaktivacije bojila, jer se ta dva režima najčešće miješaju.

Talasna dužina određuje učestvuje li bojilo

Metilensko plavilo u vodi snažno apsorbira crvenu svjetlost u monomernom obliku, s maksimumom blizu 664 do 665 nm i ramenom apsorpcijske trake na kraćoj talasnoj dužini, blizu 610 nm, koje raste kako bojilo agregira u dimere i veće naslagane strukture. Molarni ekstinkcijski koeficijent blizu maksimuma je reda veličine 65,000 do 85,000 M-1 cm-1, pa su već mikromolarne otopine intenzivno plave. Rani pregled fotohemije metilenskog plavila s DNK i biološkim supstratima dokumentira ovo apsorpcijsko ponašanje i hemiju pobuđenog stanja koja slijedi: apsorpcija dovodi molekule u kratkoživuće singletno stanje, nakon čega prelaze u dugotrajnije tripletno stanje s prijavljenim prinosima blizu 0.5, koje kisik u otopini s prisutnim zrakom gasi unutar približno 2 mikrosekunde.

U tom koraku gašenja razdvajaju se dva fotohemijska puta. U hemiji tipa II tripletno bojilo prenosi energiju na kisik u osnovnom stanju i proizvodi singletni kisik, s često navođenim prinosima blizu 0.52. U hemiji tipa I triplet umjesto toga prenosi elektron ili vodik na supstrat, stvarajući radikale, uključujući superoksidne i hidroksilne vrste. Oba puta mogu se odvijati istovremeno, a uobičajeni fotodinamički učinak ostaje snažno zavisan od kisika čak i kada mu doprinosi tip I.

Iz toga proizlazi jednostavno pravilo za izbor talasne dužine za metilensko plavilo. Crvena svjetlost od približno 630 do 680 nm preklapa se s apsorpcijskom trakom bojila, a 660 do 665 nm je blizu maksimuma monomera, pa može pokretati hemiju fotosenzibilizatora svuda gdje je prisutna značajna količina bojila. Bliska infracrvena svjetlost pri 810 nm nalazi se daleko izvan apsorpcijske trake osnovnog stanja, pa je slabo prikladna za direktno pobuđivanje bojila. Koncentracija dodatno usložnjava ovu sliku: kako raste, sve više bojila nalazi se u dimernim i agregiranim oblicima koji apsorbiraju prema 610 nm i manje efikasno fotosenzibiliziraju po molekuli, pa udvostručavanje količine bojila ne udvostručava učinak. Prateći pregled metilenskog plavila i terapije crvenom svjetlošću tretira ovo pravilo apsorpcije kao preduvjet za svaku fotosenzibiliziranu reakciju.

Iradijansa, trajanje i fluenca su tri parametra, a ne jedan

Fluenca, izražena u J po kvadratnom cm, jednaka je iradijansi pomnoženoj s vremenom. Navođenje samo fluence skriva brzinu kojom je energija pristizala, a ta brzina je važna.

Visoka iradijansa tokom kratkog vremena i niska iradijansa tokom dugog vremena mogu dati istu fluencu uz različitu hemiju. Visoka iradijansa troši otopljeni kisik brže nego što ga difuzija nadoknađuje, što tokom izlaganja ograničava put tipa II zavisan od kisika. Ona također unosi toplotu, a tkivo na zagrijavanje odgovara promjenama protoka krvi koje mijenjaju i oksigenaciju i raspodjelu bojila. Niska iradijansa tokom dugog izlaganja omogućava održavanje dotoka kisika, ali procesima popravke i ponovne oksigenacije daje vrijeme da djeluju tokom samog izlaganja. Udžbenici fotohemije pretpostavku da je važna samo ukupna doza nazivaju reciprocitetom. Ona ne vrijedi kad god učestvuju kisik, zagrijavanje ili biološki procesi, što u tkivu znači gotovo uvijek.

Antimikrobna fotodinamička izlaganja s metilenskim plavilom kod ljudi obično koriste 6 do 18 J po kvadratnom cm, što se preklapa s vrijednostima u fotobiomodulaciji. Sama fluenca zato ne može odrediti režim. Izlaganje od 10 J po kvadratnom cm pri 660 nm u tkivu koje sadrži bojilo predstavlja fotohemiju koju pokreće fotosenzibilizator. Ista fluenca pri 810 nm u tkivu s tragovima bojila predstavlja nešto sasvim drugo. Broj se podudara. Koncept se razlikuje.

Optički put i geometrija uzorka određuju na šta svjetlost nailazi

Beer-Lambertov zakon znači da prednji dio uzorka prima daleko više svjetlosti od stražnjeg. U kiveti s desetinama mikromola bojila po litru prvi milimetar može apsorbirati većinu upadne crvene svjetlosti, ostavljajući dublje slojeve praktično neizloženim. Smjestite istu otopinu u plitki bunarić s malom zapreminom i izlaganje postaje gotovo ujednačeno. Isto bojilo, ista lampa, ista fluenca na površini, drugačiji rezultat.

U tkivu se apsorpciji pridružuje raspršenje. Crvena svjetlost blizu 660 nm prodire do dubine reda veličine milimetara, pri čemu tačnu dubinu određuju sadržaj krvi, pigmentacija i vrsta tkiva. Bunarići unose vlastite artefakte: djelovanje meniskusa poput leće, refleksiju od zidova, zasjenjivanje rubnih bunarića i zagrijavanje malih zapremina ispod izvora. Dvije laboratorije koje navode identične postavke lampe, ali različite vrste ploča, zapremine ili udaljenosti izvora, provele su različite eksperimente.

Udaljenost zaslužuje poseban naglasak jer je najčešća varijabla koja ostaje neprijavljena. Iradijansa brzo opada s udaljenošću od nekolimiranog izvora, pa pomjeranje lampe s 2 cm na 5 cm iznad ploče može višestruko smanjiti iradijansu, dok odjeljak o metodama ostaje isti. Bez izmjerene iradijanse na površini uzorka, objavljene fluence izračunate iz podataka proizvođača o snazi predstavljaju procjene, a ne mjerenja.

Vodič kroz parametre s napomenama: šta izlaganje čini ponovljivim

Izvorni materijal za ovu stranicu je kontrolna lista. Izlaganje svjetlosti u studiji koje izostavlja ove stavke ne može se porediti s drugim, ma koliko slično izgledala istaknuta doza.

1. Talasna dužina i širina spektra. Maksimum i puna širina, a ne naziv boje. Crvene LED diode obuhvataju 630 do 680 nm, gdje se apsorpcija bojila znatno razlikuje.
2. Izmjerena iradijansa na površini uzorka, u mW po kvadratnom cm. Snaga u vatima koju navodi proizvođač nije iradijansa.
3. Trajanje i pulsiranje. Kontinuirana ili pulsna isporuka, uključujući frekvenciju impulsa i radni ciklus gdje je primjenjivo.
4. Fluenca izračunata iz prethodno navedenog para izmjerenih vrijednosti, u J po kvadratnom cm.
5. Koncentracija bojila, formulacija i stanje agregacije. Monomer blizu 664 nm fotosenzibilizira drugačije od agregata blizu 610 nm.
6. Interval između primjene lijeka i svjetlosti. Minute do sati između primjene bojila i ozračivanja, što određuje gdje se bojilo nalazi kada svjetlost stigne.
7. Oksigenacija. Otopina s prisutnim zrakom u odnosu na hipoksično tkivo direktno mijenja ravnotežu između tipa I i tipa II.
8. Geometrija. Dubina uzorka, zapremina, vrsta posude, udaljenost i ugao izvora te dubina ciljnog područja u tkivu.

Korisna navika pri čitanju radova: prvo provjerite interval između primjene lijeka i svjetlosti. On otkriva namjeru. Fotodinamički eksperimenti namjerno ozračuju tkivo koje sadrži bojilo. Kombinirani eksperimenti mogu ih namjerno vremenski razdvojiti, kao u nastavku.

Bliska infracrvena fotobiomodulacija nije fotoaktivacija bojila

Fotobiomodulacija, obično skraćeno PBM, koristi crvenu ili blisku infracrvenu svjetlost za moduliranje endogene signalizacije bez dodavanja fotosenzibilizatora. Fotodinamička terapija, obično skraćeno PDT, koristi tri komponente zajedno: svjetlost koju senzibilizator apsorbira, sam senzibilizator i kisik, kako bi stvorila nagli porast reaktivnih vrsta koje oštećuju cilj. Pregled mitohondrija kao cilja neuroprotekcije povezuje metilensko plavilo s PBM-om jer različitim putevima djeluju na ćelijsko disanje: bojilo djeluje kao katalitički redoks posrednik koji podržava tok elektrona, dok se pretpostavlja da PBM potiče odvajanje inhibitornog azot-monoksida od citohrom c oksidaze u kompleksu IV. Taj enzimski mehanizam treba ostati označen kao hipoteza.

Dvije najčešće citirane studije kombinacije na miševima koriste svjetlost pri 810 nm, što je upravo razlog zašto ne pokazuju fotoaktivaciju bojila. U studiji predtretmana prije uskraćivanja sna, miševi su prije uskraćivanja sna svakodnevno primali metilensko plavilo u dozi od 0.5 mg po kg, pulsni laser pri 810 nm svaki drugi dan ili oboje. Kombinirani predtretman zaštitio je ponašanja povezana s pamćenjem i sinaptičke proteine hipokampusa, dok pojedinačni tretmani uglavnom nisu uspjeli. U studiji hroničnog stresa s istovremenim tretmanom, miševi su primali PBM pri 810 nm s 8 J po kvadratnom cm uz svakodnevno bojilo u dozi od 0.5 mg po kg, pri čemu je laser primijenjen prvi, a bojilo ubrizgano dva sata kasnije upravo radi izbjegavanja ozračivanja tkiva koje sadrži bojilo. Sva tri tretmanska kraka poništila su deficite u učenju, uz aditivnu korist uglavnom za kortizol u serumu i reaktivne kisikove vrste u mozgu. Ovi rezultati ispituju dvije mitohondrijske intervencije koje se koriste zajedno, a zbirka fotodinamičkih studija zadržava tu razliku jasno vidljivom bilježenjem talasne dužine za svaku indikaciju.

Dokazi vezani za kožu pripadaju drugom režimu. Podaci o metilenskom plavilu u kombinaciji sa svjetlošću na koži ljudi uglavnom se odnose na 630 do 680 nm, uz topikalno ili intralezijsko bojilo i namjeru uništavanja ili remodeliranja, što je po definiciji PDT. Navođenje tog uklanjanja promjena kao dokaza da bojilo pojačava PBM ili navođenje oporavka kod miševa pri 810 nm kao dokaza da panel pri 660 nm uz bojilo predstavlja protokol za kogniciju miješa ova dva režima. Referentni pregled doziranja i farmakologije te vodič kroz sigurnost i interakcije dalje razrađuju dijelove ove teme koji se odnose na koncentraciju i kontraindikacije.

Imenujte koncept prije poređenja brojeva. Talasna dužina određuje apsorbira li bojilo svjetlost. Iradijansa i trajanje određuju šta se u hemijskim procesima događa nakon te apsorpcije. Geometrija određuje koji dio uzorka uopće doživljava bilo šta od toga. Dva izlaganja koja se podudaraju u jednom parametru, a razlikuju u ostalima, predstavljaju različite eksperimente, a njihovo tretiranje kao međusobno zamjenjivih upravo je greška koju ovaj vodič nastoji spriječiti. Ništa od ovoga ne daje osnovu za kućni protokol; svjetlost talasne dužine kompatibilne s bojilom, uz sistemski primijenjeno bojilo, pretvara izlaganje koje bi inače bilo modulacijsko u fotohemiju koju pokreće fotosenzibilizator, što pripada kliničkoj praksi.