Mjerenje mitohondrijskih efekata metilenskog plavila: kisik, ATP i membranski potencijal

Pretpostavimo da laboratorij doda metilensko plavilo mitohondrijama s poremećenim disanjem i zabilježi porast potrošnje kisika. Prirodno bi bilo napisati da je boja obnovila mitohondrijsku funkciju. Ta tvrdnja može biti pogrešna. Tok kisika, sinteza ATP-a i membranski potencijal tri su različita pojma. Dijele istu organelu kao što sigurnosno kopiranje, sinhronizacija i dijeljenje dijele istu mapu u oblaku: povezani su, ali podliježu različitim pravilima. Zamijenite li jedno drugim, tumačenje neće biti valjano, čak i kada je svako mjerenje tehnički ispravno.

Metilensko plavilo povećava vjerovatnoću takve zabune jer učestvuje u sistemu koji se mjeri. Ono kruži kroz redoks-reakcije, prihvatajući elektrone u ranijim i predajući ih u kasnijim dijelovima lanca, predstavlja lipofilni kation koji se nakuplja u mitohondrijama s uspostavljenim energetskim gradijentom i intenzivno je plavo jedinjenje koje apsorbira i emitira svjetlost u istim spektralnim područjima kao uobičajene sonde. Jedan mjerni rezultat ne može obuhvatiti sve te utjecaje. Pouzdan pristup, prikazan u mitohondrijskim studijama iz Budimpešte, jeste mjerenje toka kisika zajedno s brzinom sinteze ATP-a, membranskim potencijalom i oslobađanjem vodikovog peroksida, uz kontrole specifične za boju u svakom koraku.

Respirometrija mjeri tok kisika, a ne proizvodnju energije

Respirometrija visoke rezolucije, bilo pomoću uređaja Oroboros Oxygraph ili analizatora izvanćelijskog toka Seahorse, pokazuje jedno: koliko se brzo kisik reducira. Ne pokazuje koliko je protona preneseno po elektronu, koliki je gradijent očuvan niti je li ga ATP-sintaza iskoristila.

Terminologija je važna. U izoliranim mitohondrijama supstrat bez ADP-a omogućava mjerenje disanja usljed propuštanja protona, supstrat uz zasićujuću koncentraciju ADP-a daje kapacitet oksidativne fosforilacije, a titracija razdvajačem daje maksimalni kapacitet prijenosa elektrona. U intaktnim ćelijama odgovarajuće mjere na uređaju Seahorse jesu bazalno disanje, disanje povezano s ATP-om osjetljivo na oligomicin, propuštanje protona, maksimalno disanje određeno FCCP-om i nemitohondrijska potrošnja kisika otporna na rotenon i antimicin. Nazivanjem rezultata mjerenja na uređaju Seahorse stanjem 3 i stanjem 4 pripisuje se preciznost koju takav preparat ne omogućava, kao što jasno pokazuje Agilentov okvir Mito Stress Test.

Metilensko plavilo narušava intuitivnu vezu između više kisika i više energije. U izoliranim mitohondrijama mozga zamorca boja u koncentracijama od 100 nM do 1 uM povećala je potrošnju kisika u mirovanju uz glutamat i malat, sukcinat i alfa-glicerofosfat kao supstrate, s porastom od približno 64 posto uz alfa-glicerofosfat. Ipak, disanje stimulirano ADP-om u zdravim mitohondrijama ostalo je praktično nepromijenjeno, prema studiji izoliranih mitohondrija mozga. Budući da je disanje usljed propuštanja poraslo, a tok stimuliran ADP-om ostao nepromijenjen, izračunati omjer respiratorne kontrole opada. Taj pad ne znači da je boja oštetila mitohondrije. Znači da je boja uz normalno disanje dodala redoks-ciklus koji troši kisik. Test potrošnje kisika s metilenskim plavilom koji prikazuje samo taj porast izmjerio je stvarnu hemijsku reakciju, ali nije rekao ništa o očuvanju energije.

Eksperimenti obnove funkcije pokazuju isti nesrazmjer u većem obimu. Uz blokiran kompleks I, tok kisika povećao se približno trostruko, dok se sinteza ATP-a povećala samo oko 1.5 puta. Više kisika stiglo je do elektrode. Manji dio te potrošnje doprinio je stvaranju ATP-a. Svaka tvrdnja o poboljšanoj oksidativnoj fosforilaciji zahtijeva i podatke o ATP-u, idealno izražene kao omjer ATP-a i kisika, uz navedenu konvenciju za nazivnik.

Testovi ATP-a mjere brzinu sinteze, koju količina ATP-a ne može zamijeniti

Test ATP-a odgovara na drugo pitanje: koliko se ATP-a stvara po jedinici vremena. Kinetičko mjerenje, bilo praćenjem luminiscencije luciferaze krijesnice tokom nekoliko minuta ili spregnutim testom s heksokinazom i glukoza-6-fosfat-dehidrogenazom koji se očitava na 340 nm, daje brzinu. Jedno mjerenje ukupnog ATP-a u završnoj tački daje njegovu količinu, koja odražava razliku između sinteze i potrošnje i sama po sebi malo govori o oksidativnoj fosforilaciji.

Grupa iz Budimpešte koristila je spregnutu enzimsku metodu uz inhibiranu adenilat-kinazu i utvrdila da metilensko plavilo u koncentracijama od 1 do 2 uM umjereno, ali značajno povećava proizvodnju ATP-a u mitohondrijama tretiranim rotenonom i antimicinom. To je stvarna, ali djelimična obnova funkcije. Studija toksičnosti TEGDMA dala je sličan rezultat u drugačijem modelu: dentalni monomer TEGDMA u koncentraciji od 5 mM smanjio je disanje povezano s kompleksom I s približno 286 na 28 jedinica toka, a boja u koncentraciji od 2 uM vratila ga je na približno 86.

Kod obojenog redoks-jedinjenja dvije kontrole su obavezne. Prvo, provedite mjerenje uz oligomicin kako biste utvrdili koliki dio izmjerene sinteze ATP-a zavisi od ATP-sintaze. Drugo, provedite test povrata dodanog ATP-a u sistemu bez ćelija, s poznatom količinom ATP-a, kompletnim reagensom i tačno onim koncentracijama boje koje su korištene, najmanje 0, 100 nM, 300 nM, 1 uM i 2 uM. Boja može apsorbirati emitovanu svjetlost, inhibirati reporterski enzim ili promijeniti redoks-hemiju reagensa, a opće smjernice za testove s luciferazom preporučuju dodatne biohemijske provjere upravo za ovu vrstu interferencije. Ne pretpostavljajte da koncentracija od 1 uM ne stvara artefakte samo zato što je gašenje signala obično izraženije pri višim koncentracijama.

Sonde za membranski potencijal mjere raspodjelu boje, a ne tok

Safranin O, TMRM i TMRE, rodamin 123 i JC-1 jesu kationi koji prolaze kroz membranu. Nakupljaju se u negativno nabijenom matriksu prema elektrohemijskoj ravnoteži, pa ukupna fluorescencija indirektno odražava potencijal kroz raspodjelu sonde. Nijedna od njih ne mjeri ATP niti tok elektrona.

Svaka sonda ima preparat kojem najbolje odgovara. Safranin O pogodan je za izolirane mitohondrije i permeabilizirane ćelije, obično pri koncentraciji oko 2 uM, s ekscitacijom oko 495 nm i emisijom oko 585 nm. Djeluje u režimu gašenja fluorescencije, u kojem unos mijenja ukupnu fluorescenciju. TMRM i TMRE pogodni su za intaktne ćelije pri niskim nanomolarnim koncentracijama bojenja u režimu bez gašenja, u kojem depolarizacija oslobađa boju i mitohondrijska fluorescencija opada; pri visokom unosu boje smjer promjene signala može se preokrenuti zbog samogašenja. JC-1 daje praktičan omjer zelenog i crvenog signala, ali zavisi od unosa boje i mitohondrijske mase, što ga čini slabijim izborom za kvantitativni rad od pažljivo kontroliranog TMRM-a. Ovi kompromisi sažeti su u široko korištenom pregledu sondi za mitohondrijski membranski potencijal.

Metilensko plavilo izaziva optičku interferenciju upravo pri radnim koncentracijama. Njegove apsorpcijske trake oko 600 do 665 nm preklapaju se s crvenom emisijom sondi, pa su efekti unutrašnjeg filtera, gašenje fluorescencije i apsorpcija ekscitacijske svjetlosti realne mogućnosti. Boja je ujedno drugi lipofilni kation čija se vlastita raspodjela mijenja s potencijalom koji se mjeri. Zaštita od pogrešnog tumačenja jeste upotreba više mjernih pristupa uz slijepe probe: samo sonda, samo boja, sonda uz svaku koncentraciju boje, potpuna depolarizacija FCCP-om kao nulta referenca i, idealno, druga sonda s različitim optičkim svojstvima. Studija zaobilaženja kompleksa III uspostavila je taj pristup ponavljanjem mjerenja obnove membranskog potencijala pomoću safranina O i TMRM-a nakon inhibicije antimicinom i miksotiazolom, pri čemu je dobijena ista kvalitativna obnova. Jedan optički reporter daje naznaku. Dva nezavisna reportera daju dokaz.

Tri preparata, tri različita pitanja

Izolirane mitohondrije, permeabilizirane ćelije i intaktne ćelije nisu međusobno zamjenjive postavke osjetljivosti istog testa. To su različiti pristupi s različitim principima rada.

Izolirane mitohondrije zadržavaju lanac prijenosa elektrona, unutrašnju membranu i funkcionalni aparat matriksa, dok se uklanjaju plazmatska membrana, citosol i mrežna organizacija. Upravo je to svrha uklanjanja: supstrati, ADP, inhibitori i koncentracije boje tačno su definirani, pa se može odrediti uključeni put. Cijena je gubitak prirodne opskrbe supstratima, signalizacije i energetskih potreba.

Permeabilizirane ćelije zadržavaju mitohondrije unutar velikog dijela njihove ćelijske organizacije, a kroz otvorenu plazmatsku membranu propuštaju egzogene supstrate i ADP. Odgovarajući su alat za utvrđivanje poremećaja određenog supstratnog puta u ćelijskom kontekstu. Pretjerana permeabilizacija oštećuje vanjsku membranu, a citosolna regulacija gubi se ispiranjem.

Intaktne ćelije zadržavaju sve: barijeru plazmatske membrane, citosolne reduktante, transport endogenih supstrata, mitohondrijsku mrežu i potrebe za ATP-om. Najbliže su fiziologiji i najudaljenije od razjašnjavanja mehanizma jer unos, redukcija i sekvestracija boje zajedno određuju efektivnu izloženost mitohondrija.

Studija TEGDMA namjerno je koristila sva tri nivoa: izolirane mitohondrije mozga za ispitivanje obnove oksidacije i potencijala pomoću boje, permeabilizirane matične ćelije zubne pulpe prvenstveno za lokalizaciju poremećaja na oksidaciju supstrata povezanu s kompleksom I i intaktne matične ćelije za fiziološki neto efekat boje u koncentraciji od 2 uM na smanjenu potrošnju kisika. Čitaocima koji porede mitohondrijske mjerne rezultate između različitih preparata prateći tekst o tome kako metilensko plavilo prenosi elektrone kroz respiratorni lanac pruža osnovu za razumijevanje puteva, a vodič za čitanje studija disanja s metilenskim plavilom objašnjava logiku koncentracija i inhibitora.

Kontrole koje zahtijeva redoks-aktivna boja

Boja koja kruži kroz redoks-reakcije zahtijeva duži popis kontrola od običnog inhibitora jer hemijske reakcije same boje mogu oponašati biološke procese.

Za respirometriju provedite mjerenje u komori samo s puferom radi provjere pomaka signala, u komori s puferom i bojom bez biološkog materijala, s bojom i svakim izvanćelijskim reduktantom prisutnim u testu te završno mjerenje uz rotenon i antimicin radi određivanja nemitohondrijske potrošnje kisika u intaktnim ćelijama. Imajte na umu da se reducirana boja ponovo oksidira prijenosom elektrona na kisik uz stvaranje vodikovog peroksida. Zato slijepa proba samo s bojom, bez donora elektrona, potcjenjuje potrošnju kisika u sistemu bez ćelija koja se javlja kada NADH ili NADPH postanu dostupni.

Za vodikov peroksid dajte prednost kalibriranom Amplex UltraRedu uz peroksidazu hrena u odnosu na neselektivne boje DCFDA, provjerite rezultat katalazom i ispitajte zavisnost od osvjetljenja jer je boja fotosenzibilizator. Studija mitohondrija mozga utvrdila je da je opterećenje peroksidom poraslo više od četiri puta već pri koncentraciji boje od 100 nM, dok se eliminacija usporila, pri čemu je peroksid nastajao direktno djelovanjem reducirane boje, bez superoksida kao međuprodukta. Detalji izbora sonde i kontrola osvjetljenja obrađeni su u pratećem tekstu o mjerenju reaktivnih kisikovih vrsta u eksperimentima s bojama, a šire pitanje kada peroksid djeluje kao signal, a kada kao opterećenje obrađeno je uz ćelijsku redoks-ravnotežu i tvrdnje o antioksidansima.

Za tvrdnje o putevima ispitajte oba mjesta djelovanja inhibitora kompleksa III: antimicin A na mjestu Qi i miksotiazol na mjestu Qo, uz završnu provjeru kompleksa IV cijanidom. Ranija studija mozga miša izvijestila je da boja obnavlja disanje blokirano rotenonom, ali ne i disanje blokirano antimicinom. Kasnija studija na tri vrste utvrdila je djelimičnu obnovu uz oba inhibitora i dokaze direktne redukcije citohroma c. Zaobilaženje posmatrajte kao objašnjenje usklađeno s novijim podacima, a ne kao konačno utvrđen mehanizam, jer koncentracija boje, mjesto djelovanja inhibitora, stanje supstrata i raspodjela boje mijenjaju uočeni put.

Matrica za izbor testova

Koristite ovu tabelu da odaberete mjerenje prema pitanju, a ne obrnuto.

Za minimalno uvjerljivu tvrdnju potrebno je iste koncentracije boje, 100 nM, 300 nM, 1 uM i 2 uM, ispitati mjerenjem toka kisika u uslovima propuštanja protona, uz ADP, uz oligomicin i uz razdvajač, zatim mjerenjem brzine sinteze ATP-a, membranskog potencijala po mogućnosti s dvije sonde te kalibriranog oslobađanja peroksida uz katalazu i kontrole bez ćelija. Prikažite povezani skup rezultata: tok kisika, brzinu sinteze ATP-a, ATP po kisiku, potencijal i peroksid. Bilo koji od tih brojeva sam za sebe predstavlja mjerenje kojem tek treba dati značenje.