Metilensko plavilo i azot-monoksid: NOS, cGMP i vaskularna signalizacija

Pitanje zvuči jednostavno: da li metilensko plavilo inhibira azot-monoksid? U laboratoriji se odgovor razdvaja na četiri zasebna pitanja, a svako zahtijeva drugačiju eksperimentalnu provjeru. Njihovo miješanje glavni je razlog zbog kojeg tekstovi o metilenskom plavilu i azot-monoksidu zvuče samouvjereno, ali ostaju neodređeni.

Zamislite signal azot-monoksida kao lanac s četiri karike. Gen se transkribira kako bi nastala sintaza azot-monoksida. Enzim pretvara arginin u azot-monoksid. Gas difundira do svoje mete prije nego što reagira s nečim drugim. Rastvorljiva gvanilat-ciklaza ga prepoznaje i stvara ciklični GMP. Objavljena istraživanja opisuju djelovanje metilenskog plavila na svaku kariku, ali dokazi potječu iz različitih preparata, pri različitim koncentracijama i za različite izoforme. Rezultat na jednoj karici ne dokazuje djelovanje na drugoj.

Kanonski lanac, jednostavno objašnjen

U zidu krvnog suda standardni slijed izgleda ovako. Podražaj djeluje na endotelnu ćeliju. Endotelna sintaza azot-monoksida, nazvana eNOS ili NOS3, stvara mali puls azot-monoksida. Gas difundira u susjednu glatku mišićnu ćeliju, veže se za hem s reduciranim željezom u rastvorljivoj gvanilat-ciklazi i ubrzava pretvaranje GTP u ciklični GMP. Ciklični GMP aktivira protein-kinazu G, mijenja se regulacija kalcija i mišić se opušta.

Postoji i drugi lanac koji treba razmatrati zasebno. Tokom infekcije ili izlaganja citokinima, ćelije transkribiraju gen za drugi enzim, inducibilnu sintazu azot-monoksida ili iNOS, koja se naziva i NOS2. Ona proizvodi veće i dugotrajnije tokove azot-monoksida nego eNOS. Treća izoforma, neuronalna NOS ili nNOS, pripada još jednom kontekstu. Kada rad spominje sintazu azot-monoksida bez navođenja izoforme, zastanite i provjerite koja je mjerena. Pregled načina na koji metilensko plavilo prenosi elektrone ističe isto i za redoks mete općenito: prijenosnik ne djeluje samostalno, a partner na svakom kraju određuje ishod.

Izmjereni ciklični GMP također je zbirni pokazatelj, a ne direktni enzimski test. Njegov nivo odražava sintezu koju obavlja ciklaza umanjenu za razgradnju koju obavljaju fosfodiesteraze, posebno PDE5 u glatkim mišićima krvnih sudova. Pad cikličnog GMP stoga znači da je do detektora stiglo manje signala. Sam po sebi ne otkriva koja je karika zakazala.

Karika 1: stvara se manje enzima iNOS

U mišjim makrofagima stimuliranim bakterijskim lipopolisaharidom, interferonom gama ili obama, metilensko plavilo spriječilo je očekivani porast proteina iNOS i snažno smanjilo glasničku RNK za iNOS u eksperimentima transkripcije u makrofagima. Posebno je informativno ono što se nije promijenilo. Razgradnja inhibitora I kapa B alfa, fosforilacija NF kapa B i STAT1 te prelazak tih faktora u jedro ostali su uglavnom očuvani. Smanjilo se njihovo vezivanje za DNK, što je potvrđeno imunoprecipitacijom hromatina koja je pokazala smanjenu zauzetost promotora iNOS.

To je učinak na regulaciju gena koji prethodi promjeni količine enzima, a ne akutna blokada postojećeg enzima. Pripada upalnoj signalizaciji, u kojoj se transkripcijski faktori moraju vezati za promotor prije nego što se pojavi protein. Ne govori ništa direktno o konstitutivnoj eNOS u krvnom sudu u mirovanju i treba ga opisivati u tim okvirima.

Karika 2: postojeći enzim NOS radi sporije

Studija na štakorima ispitivala je drugi nivo. Svjesni mužjaci štakora primili su lipopolisaharid intravenski, a zatim tri sata kasnije fiziološku otopinu ili metilensko plavilo u količini od 3 mg po kg intravenski. Aktivnost sintaze azot-monoksida u medijalnom bazalnom hipotalamusu mjerena je pretvaranjem obilježenog arginina u citrulin u studiji aktivnosti hipotalamičke NOS. Sam stres uz fiziološku otopinu inducirao je određenu aktivnost nezavisnu od kalcija, a lipopolisaharid ju je povećao na približno deset puta kontrolni nivo. Metilensko plavilo uklonilo je obje inducirane komponente. Konstitutivna aktivnost zavisna od kalcija nije se promijenila u tom tkivu pri toj dozi i u toj vremenskoj tački.

Taj rezultat tumačite tačno onako kako je naveden: izmjerena aktivnost tipa iNOS bila je smanjena u tim uslovima. To nije mjerenje ekspresije gena niti dokaz trajne selektivnosti za iNOS u odnosu na eNOS ili nNOS. Rad s pročišćenim enzimima dodatno naglašava potrebu za oprezom. U direktnim testovima pročišćene sintaze azot-monoksida, metilensko plavilo potpuno je blokiralo stvaranje citrulina pri 30 mikromolar, uz koncentraciju za polovinu inhibicije od približno 5.3 mikromolar bez superoksid-dismutaze i 9.2 mikromolar s njom, kako je navedeno u poređenju pročišćene NOS i gvanilat-ciklaze. Zasebna studija pročišćene nNOS ukazala je na oksidaciju hema vezanog za enzim. Praktični zaključak je da direktna inhibicija NOS postoji u izoliranim sistemima, ali rezultat iz hipotalamusa ne može se proširiti u opću tvrdnju da metilensko plavilo svuda ostavlja sve konstitutivne NOS netaknutim.

Karika 3: azot-monoksid se gubi prije nego što stigne

Najjasniji dokaz da se pad cikličnog GMP može objasniti nečim drugim osim blokadom enzima dolazi iz kultiviranih glatkih mišićnih ćelija plućne arterije kunića. Eksperimentalni postupak potpuno je zaobišao endogenu NOS direktnim dodavanjem donora azot-monoksida, a zatim je ispitano da li metilensko plavilo i dalje smanjuje odgovor cikličnog GMP u studiji superoksida u glatkim mišićima krvnih sudova.

Tri donora ispitana su u rasponu od 1 do 100 mikromolar: S-nitrozo-L-cistein, natrijev nitroprusid i stabilni deaminirani analog nazvan MPANO. Svi su povećali ciklični GMP približno 1.5 do 12 puta. Metilensko plavilo pri 10 mikromolar inhibiralo je odgovor na prva dva za 51 do 100 posto, dok je odgovor na MPANO ostao nepromijenjen. Kada bi metilensko plavilo jednostavno blokiralo katalitičko mjesto ciklaze, tu selektivnost prema donorima bilo bi teško objasniti jer sva tri djeluju preko istog nizvodnog enzima.

Tri kontrolna postupka zatim su povezala mehanizam sa superoksidom. Prvo, stvaranje izvanćelijskog superoksida pomoću ksantina i ksantin-oksidaze ponovilo je isti obrazac: odgovori na CYSNO i nitroprusid bili su blokirani, a odgovor na MPANO očuvan. Drugo, metilensko plavilo izazvalo je stvaranje superoksida u glatkim mišićnim ćelijama zavisno od doze i vremena, što je izmjereno redukcijom citohroma c. Treće, superoksid-dismutaza potpuno je spriječila inhibiciju, dok katalaza nije, što ukazuje na superoksid, a ne na vodikov peroksid, kao neposredno odgovornu hemijsku vrstu u tom preparatu.

Vrijedi opisati i verziju eksperimenta sa zajedničkom kulturom jer ona prostorno određuje mjesto djelovanja. Endotelne ćelije na pokrovnim stakalcima kratko su uzgajane zajedno s glatkim mišićnim ćelijama, pa je bazalno oslobođeni endotelni faktor povećao ciklični GMP u glatkim mišićima tri do osam puta. Prethodna obrada bilo kojeg od ta dva odjeljka metilenskim plavilom smanjila je taj signal, a superoksid-dismutaza djelimično je poništila učinak prethodne obrade endotela. Drugim riječima, metilensko plavilo uopće ne mora djelovati unutar glatke mišićne ćelije koja detektira signal. Može oslabiti signal uklanjanjem glasnika tokom njegovog prijenosa. Vodič za čitanje istraživanja o metilenskom plavilu tretira to kao opće pravilo: navedite odjeljak u kojem je intervencija provedena prije nego što navedete molekularnu metu.

Bilo bi pogrešno to nazvati inhibicijom NOS. Za djelovanje donora nije bio potreban korak koji uključuje sintazu, a signal se ipak smanjio.

Karika 4: sam detektor slabije reagira

Direktni učinci na rastvorljivu gvanilat-ciklazu postoje, ali koncentracije su važne. U prethodno navedenom poređenju pročišćenih enzima, ciklazi stimuliranoj azot-monoksidom bilo je potrebno približno 60 mikromolar metilenskog plavila za polovinu inhibicije, u odnosu na približno 5 do 9 mikromolar za polovinu inhibicije NOS, a čak je i 1 milimolar proizveo samo djelimičnu maksimalnu blokadu. To je razlika od približno šest do jedanaest puta. Zato se ćelijski eksperiment pri niskoj mikromolarnoj koncentraciji koji smanjuje ciklični GMP ne može označiti kao selektivna inhibicija ciklaze samo na osnovu vrijednosti cikličnog GMP.

Kasnija redoks studija dodala je još jedan razlog za oprez: metilensko plavilo deaktiviralo je ciklazu aktiviranu azot-monoksidom mehanizmom različitim od jednostavne oksidacije željeza u hemu djelovanjem zraka. Dakle, funkcija detektora može biti oslabljena, ali hemijski mehanizam nije razjašnjen, a razlika u koncentracijama znači da pri izlaganju niskim mikromolarnim koncentracijama prvo treba isključiti učinke superoksida i NOS. Ovdje pripada i kontrola djelovanja fosfodiesteraza. Ako razgradnja nije izmjerena ili blokirana, smanjeno nakupljanje cikličnog GMP može odgovarati smanjenoj sintezi, bržoj razgradnji ili objema.

Zašto se ovo ne može svesti na jednu tvrdnju o krvnom pritisku

Svaka karika utvrđena je u drugačijem sistemu. Transkripcija u makrofagima nije isto što i aktivnost enzima u hipotalamusu. Aktivnost u hipotalamusu nakon lipopolisaharida nije isto što i endotelni tonus u mirovanju. Bazalno oslobođeni endotelni faktor u zajedničkoj kulturi nije isto što i vazodilatacija stimulirana agonistom. Kultivirane ćelije plućne arterije pri 10 mikromolar metilenskog plavila nisu ljudski krvotok. Svođenje tih nalaza na tvrdnju poput one da metilensko plavilo povećava krvni pritisak blokiranjem azot-monoksida zanemaruje upravo one razlike koje su kontrolni postupci osmišljeni da očuvaju.

Tri provjere omogućavaju tačno tumačenje. Prvo, navedite izoformu: eNOS za vaskularni tonus u mirovanju, iNOS za inducirani tok u upalnim procesima, nNOS za neuronalne kontekste i neke kontekste rada s pročišćenim enzimima. Drugo, navedite način na koji se signal azot-monoksida isporučuje: endogena sinteza, bazalno oslobađanje iz endotela ili određeni donor kao što su CYSNO, nitroprusid ili MPANO, jer je stabilni donor odolio djelovanju metilenskog plavila, dok labilni nisu. Treće, navedite koncentraciju i postupak poništavanja učinka: poništavanje pomoću superoksid-dismutaze ukazuje na učešće superoksida, izostanak učinka katalaze govori protiv učešća vodikovog peroksida u tom preparatu, oponašanje pomoću ksantin-oksidaze pokazuje da je taj mehanizam dovoljan, a testovi pročišćenih enzima razdvajaju direktne učinke na katalizu od gubitaka tokom prijenosa.

Sažeta sinteza glasi ovako. Metilensko plavilo prikladnije je posmatrati kao supstancu koja ometa signalizaciju od azot-monoksida do cikličnog GMP na više mjesta nego kao selektivni blokator ciklaze. Zavisno od preparata i koncentracije, može smanjiti vezivanje transkripcijskih faktora za iNOS, direktno inhibirati enzime NOS, smanjiti dostupnost azot-monoksida stvaranjem superoksida i oslabiti funkciju ciklaze aktivirane azot-monoksidom. Uloga signalizacije cikličnog GMP u vaskularnim studijama i poređenje donora azot-monoksida korištenih u ćelijskim testovima detaljnije obrađuju po jednu od tih grana, a metode za razdvajanje redoks učinaka od učinaka na enzime objašnjavaju zašto se kombinacija superoksid-dismutaze, katalaze i kontrolnog postupka sa stabilnim donorom tako često pojavljuje u ovoj literaturi.

Niska vrijednost cikličnog GMP nakon metilenskog plavila pokazuje da je lanac prekinut. Samo kontrolni postupci otkrivaju koja je karika pukla.