Metilensko plavilo i autofagija: AMPK, mTOR i eksperimenti na neuronskim ćelijama

Zamislite da provodite eksperiment na ćelijama, dodate metilensko plavilo i primijetite da proteinska traka nazvana LC3-II postaje tamnija na vašem blotu. Primamljivo je objaviti da spoj „pojačava autofagiju“ i nastaviti dalje. Takvo tumačenje je preuranjeno. Tamnija traka LC3-II može značiti da ćelija stvara više vezikula za uklanjanje otpada, ali može značiti i da se vezikule gomilaju jer je korak razgradnje blokiran. Ta dva tumačenja upućuju na suprotne procese, a literatura o metilenskom plavilu u neuronskim modelima sadrži primjere obje vrste dokaza. Ovaj članak objašnjava šta je zapravo mjereno, metodom po metodom.

Makroautofagija, oblik koji se ovdje proučava, predstavlja sistem recikliranja većih količina ćelijskog materijala. Membranska vrećica nazvana fagofor raste oko dotrajalih proteina i organela, zatvara se u autofagosom, spaja se s lizosomom, a njen sadržaj se razgrađuje i oslobađa za ponovnu upotrebu. Neuroni zavise od ovog redovnog procesa jer se ne dijele i ne mogu diobom smanjiti udio oštećenih dijelova. Kada recikliranje zastane, otpad se nakuplja. Kada funkcionira, ćelija pod stresom ponovo dobiva gradivne komponente.

Šta je pokazao jedan eksperiment na hipokampalnim ćelijama

Glavno istraživanje indukcije koristilo je mišje hipokampalne ćelije HT22 izložene stresu uskraćivanjem seruma tokom 24 sata. To stanje uklanja faktore rasta i trofičke signale te pokreće i apoptozu i autofagiju. Istraživači su izvijestili da je metilensko plavilo smanjilo odumiranje ćelija na način zavisan od doze te da je ta zaštita bila praćena znakovima makroautofagije.

Promjene markera bile su specifične. Difuzno bojenje LC3B preraspodijelilo se u tačkaste strukture oko jedra počevši od približno 20 nM metilenskog plavila, uz najizraženiji odgovor LC3-I i LC3-II oko 1 μM. I LC3B-I i LC3B-II povećavali su se zavisno od doze i vremena. Ključno je da je tim otišao korak dalje od statičkog blota LC3. Dodali su 10 μM hlorokina, koji blokira lizosomsko uklanjanje, i utvrdili viši nivo LC3-II uz stabilizirani p62 u ćelijama tretiranim metilenskim plavilom. Taj obrazac podržava zaključak o prometu i razgradnji zavisnim od lizosoma, a ne o pukom gomilanju. Pokazali su i da je hlorokin djelimično poništio antiapoptotički učinak, što u ovom modelu povezuje zaštitu s putem autofagije i lizosomske razgradnje.

Rezultat koji se odnosi na signalizaciju najčešće se pogrešno prenosi. Signalizacija AMPK, procijenjena mjerenjem fosforiliranog AMPK i njegovog nizvodnog cilja, fosforiliranog ACC, povećala se nakon 12 i 24 sata na način zavisan od doze. Inhibitor AMPK Compound C, primijenjen u koncentraciji 20 μM tokom posljednja 4 sata, smanjio je i fosforilaciju ACC i aktivaciju LC3. Nasuprot tome, kod fosforiliranog mTOR nije zabilježena mjerljiva supresija. Dakle, u hipokampalnim ćelijama pod stresom utvrđena je indukcija povezana s AMPK, putem koji je naizgled nezavisan od mTOR. Isti obrazac pojavio se kod živih miševa, kod kojih je tretman metilenskim plavilom inducirao markere makroautofagije u korteksu i hipokampusu.

Indukcija nije dovršen autofagijski protok

Ovdje je razlika između pojmova najvažnija. Indukcija znači da uzvodni mehanizmi stvaraju više autofagosoma. Protok znači da sadržaj prolazi cijeli put: izdvajanje, sazrijevanje, spajanje s lizosomom, razgradnju i recikliranje. Svako povećanje LC3-II predstavlja tvrdnju o indukciji dok test protoka ne potvrdi ostatak tog puta.

Standardni test protoka mjeri LC3-II uz kratkotrajnu blokadu lizosoma, poput one izazvane bafilomicinom A1 ili hlorokinom, i bez nje. Ako tretman zaista ubrzava stvaranje, blokiranje razgradnje trebalo bi dodatno povećati LC3-II. Tandemski reporter mCherry-GFP-LC3 pruža drugi uvid: strukture svijetle žuto prije spajanja s lizosomom, a samo crveno nakon što kisela sredina ugasi signal GFP. Zato veći broj tačkastih struktura koje svijetle samo crveno podržava zaključak o napredovanju u kisele autolizosome. Smanjenje nivoa proteina p62 može dodatno potvrditi promet i razgradnju sadržaja, uz napomenu da i sama transkripcija p62 reagira na stres te je treba provjeriti na nivou mRNA.

Kontrolna lista u nastavku povezuje svaku metodu korištenu u ovoj literaturi s onim što mjeri i onim što sama ne može dokazati. Čitaoci je mogu primijeniti na svaku buduću tvrdnju o makroautofagiji, uključujući argumente o postu i dugovječnosti koji se oslanjaju na ove markere.

Obratite pažnju na jednu terminološku zamku na koju tabela upozorava. Fosforilirani ACC je enzimski inhibirani oblik. Njegovo povećanje pokazuje nizvodni odgovor na AMPK, a ne aktivaciju ACC.

Izraz „inhibicija makroautofagije ukinula je neuroprotekciju“ zahtijeva istu preciznost. U modelu HT22 to znači da je ometanje puta autofagije i lizosomske razgradnje uklonilo prednost u preživljavanju koju je metilensko plavilo pružalo pri uskraćivanju seruma. To podržava zaključak da je autofagija u toj kulturi nužna ili da doprinosi zaštiti. Ne utvrđuje da je autofagija jedini zaštitni mehanizam ovog spoja, ne dokazuje da hlorokin djeluje isključivo putem autofagije, a za čvršću tvrdnju o uzročnosti bilo bi potrebno genetički izmijeniti funkciju ATG5, ATG7 ili ULK1.

Dva puta do istog mehanizma

Pojednostavljena shema pomaže u razumijevanju. Energetski stres povećava aktivnost AMPK, AMPK aktivira kompleks ULK1 i autofagija počinje. Faktori rasta i hranjive tvari povećavaju aktivnost mTORC1, mTORC1 inhibira ULK1 i autofagija ostaje neaktivna. Nizvodno od ULK1, kompleks Beclin-1 i VPS34 započinje formiranje fagofora, LC3-I se lipidacijom pretvara u LC3-II, autofagosom se zatvara, spaja s lizosomom, a sadržaj se razgrađuje uz razgradnju p62.

Dijagram smješta svaki nalaz o metilenskom plavilu na ovu shemu: rezultat iz hipokampalnih ćelija uz granu AMPK, a rezultat iz progenitorskih ćelija uz granu mTOR.

Ovakav prikaz razjašnjava prividno neslaganje s drugim istraživanjem Xiea i saradnika. U proliferirajućim neuralnim progenitorskim ćelijama štakora, zaseban eksperiment pokazao je da je 5 μM metilenskog plavila inhibiralo proliferaciju i poticalo stanje mirovanja. Broj ćelija pozitivnih na Ki67 smanjio se na dane 1 i 3, dok je diferencijacija ćelija već usmjerenih prema neuronskoj lozi ostala očuvana. Tu je mehanizam djelovao putem potisnute signalizacije mTOR: smanjeni su ukupni mTOR i fosforilirani mTOR, uz nižu ekspresiju p70S6K i 4EBP1 te smanjenu ekspresiju ciklina E1, B1, D1 i D2. Dominantni fenotip bio je mirovanje progenitorskih ćelija, koje su autori povezali s odgođenom senescencijom, a ne sa zaštitom hipokampalnih ćelija pod stresom.

Između ta dva rada nema protivrječnosti. AMPK i mTOR su integratori osjetljivi na kontekst, a ne prekidači s nepromjenjivim odgovorom. Ćelija nalik neuronu koja je pod stresom može uključiti AMPK bez mjerljive inhibicije mTOR, dok progenitorska ćelija potaknuta mitogenima može odgovoriti na isti spoj smanjenjem aktivnosti mehanizama rasta zavisnih od mTOR. Vrsta ćelije, okolnosti stresa, koncentracija i vremenska tačka mjerenja određuju koja grana dominira. Zato mitohondrijski energetski i redoks učinci metilenskog plavila također pripadaju istoj slici: kako opisuje pregled mehanizama neuroprotekcije, ovaj spoj djeluje kao alternativni prenosilac elektrona, uključuje antioksidativnu i antiapoptotičku signalizaciju, inhibira MAO i NOS te je povezan s obnovom mitohondrija putem biogeneze i autofagije. Autofagija je jedna grana pleiotropnog profila, a ne cjelokupno objašnjenje.

Šta eksperimenti ne pokazuju

Uskraćivanje seruma modelira trofički i metabolički stres u ćelijskoj kulturi. Ne modelira post cijelog organizma: glukoza, aminokiseline i soli ostaju u bazalnom mediju, a ponašanje povezano s uzimanjem hrane ne postoji. Koncentracije u kulturi od 20 nM do 5 μM ne mogu se aritmetički pretvoriti u doze za ljude jer se apsorpcija, vezivanje za proteine, redoks stanje, metabolizam, nakupljanje u tkivima i trajanje izlaganja razlikuju.

Nijedno kliničko ispitivanje na ljudima nije osmišljeno da dokaže autofagijski protok izazvan metilenskim plavilom kod pacijenata. Dokazi o mehanizmima i dalje potječu iz ćelijskih, ex vivo i životinjskih istraživanja, a pregledni radovi i dalje opisuju dokaze o primjenjivosti tih nalaza na ljude kao preliminarne. Zato ova istraživanja ne pokazuju da metilensko plavilo oponaša post, produžava ljudski život putem autofagije ili dovodi autofagijski protok do kraja u ljudskom mozgu. Tvrdnje o oponašanju posta i dugovječnosti zahtijevaju vlastite kliničke dokaze, a ispitivanja metilenskog plavila na ljudima za druge indikacije ne postaju ispitivanja autofagije samo zbog povezanosti. Istraživanja na modelima stresa izazvanog nedostatkom hranjivih tvari i modelima dugovječnosti treba čitati uz jasno uvažavanje te granice.

Na sljedeći rad koji pročitate primijenite kontrolnu listu redom. Prvo provjerite u kojoj je grani došlo do promjene: AMPK, mTOR ili ni u jednoj. Zatim provjerite je li rezultat za LC3 bio praćen testom protoka ili stoji samostalno. Potom provjerite je li blokiranje puta uklonilo korist i kojom metodom. Istraživanje koje odgovori na sva tri pitanja daje osnovu za snažnu tvrdnju o mehanizmu. Ono koje odgovori samo na prvo pokazalo je signal koji dopušta proces, a ostatak puta ostaje neistražen.