Metilensko plavilo i potporne ćelije mozga: astrociti, mikroglija i upala

Zamislite da provedete dva eksperimenta s istom plavom bojom i dobijete dva ohrabrujuća rezultata. U jednoj posudi potporne ćelije zvjezdastog oblika prežive gubitak kisika i glukoze. U drugoj, imunske ćelije mozga zadrže svoj mirni, razgranati oblik uprkos bakterijskom toksinu. Primamljivo je spojiti ta dva rezultata u jednu tvrdnju: boja smiruje upalu u mozgu i štiti mozak. Upravo je to spajanje mjesto na kojem pažljivi čitaoci trebaju zastati.

Mozak ima dvije populacije potpornih ćelija s različitim zadacima, a metilensko plavilo susreće se sa svakom od njih kroz drugačiji eksperimentalni okidač. Astrociti su ćelije koje pružaju metaboličku podršku. Nalaze se između krvnih sudova i neurona, uklanjaju višak glutamata, ublažavaju promjene koncentracije kalija, pohranjuju glikogen i prenose gorivo neuronima kada potrebe naglo porastu. Mikroglijske ćelije su stalni imunski nadzornici. Njihovi tanki nastavci nadziru tkivo, otkrivaju bakterijske signale i signale oštećenja, a pri uzbuni se povlače u zaobljeni ameboidni oblik prilagođen migraciji i fagocitozi, uz oslobađanje signalnih molekula. Rezultat u jednoj populaciji ne prenosi se na drugu, a mjerenje korišteno u svakom slučaju određuje šta je zapravo pokazano.

Astrociti pod metaboličkim stresom: vrijeme primjene je ključni rezultat

Eksperiment s astrocitima počinje uskraćivanjem. Istraživači su uzgojili kortikalne astrocite novorođenih miševa, uklonili glukozu i gotovo sav kisik na šest sati, a zatim ih ponovo omogućili tokom dvadeset četiri sata. To je laboratorijski model moždanog udara praćenog reperfuzijom. Kada je metilensko plavilo bilo prisutno tokom faze uskraćivanja, preživljavanje ćelija bilo je lošije. Kada je dodano samo tokom faze reoksigenacije, u koncentracijama od 0.1 i 1 mikromolar, preživljavanje se značajno poboljšalo prema testu vijabilnosti s kalceinom. Studija na mišjim astrocitima opisuje ovu razliku povezanu s vremenom primjene zajedno s podacima o respiraciji.

Ta razlika je najvažniji nalaz. Tokom uskraćivanja gotovo da nema kisika koji bi prihvatio elektrone, pa prijenosnik elektrona nema gdje da ih preda. Tokom reoksigenacije ćelijski mehanizmi ponovo se pokreću i boja ima svoju ulogu. Tretirani astrociti trošili su više kisika, preuzimali više glukoze, proizvodili više ATP-a i obnavljali zalihe glikogena, uz veću aktivnost heksokinaze i bez porasta mitohondrijskog superoksida. Predloženo objašnjenje je ono poznato iz prikaza metilenskog plavila kao mitohondrijskog prijenosnika elektrona: prenošenje elektrona mimo blokiranih tačaka u respiratornom lancu omogućava da se respiracija ponovo pokrene bez „curenja” elektrona koje bi stvaralo reaktivne vrste.

Obratite pažnju na vrstu dokaza. To je rezultat koji se odnosi na preživljavanje i metabolizam jedne izolirane vrste ćelija, s utvrđenim djelotvornim vremenskim periodom (oporavak, a ne uskraćivanje) i određenim rasponom koncentracija. Ne govori ništa o imunskoj signalizaciji, niti o ponašanju.

Mikroglija pod bakterijskom uzbunom: reprogramirani metabolizam

Eksperimenti s mikroglijom počinju suprotnim okidačem: ne gladovanjem, nego lažnom infekcijom. Lipopolisaharid, fragment vanjske membrane bakterija, veže se za senzore urođenog imuniteta i navodi mikrogliju da reaguje kao da su patogeni stigli, iako nema živih bakterija. Kod miševa kojima je dat lipopolisaharid i u uzgojenoj mikroglijskoj ćelijskoj liniji rezultat je poznat upalni program: raste nivo proupalnih faktora, mikroglijske ćelije polariziraju se prema agresivnom stanju M1, susjedni neuroni umiru, a životinje postižu lošije rezultate u zadacima učenja i pamćenja.

Studija na miševima povezuje ovaj odgovor s putem za prepoznavanje nivoa kisika: lipopolisaharid podstiče prekomjernu ekspresiju PHD3, jednog od tri enzima prolil-hidroksilaze, preko uzvodnog lanca Siah2/Morg1. Istovremeno ćelije reprogramiraju korištenje energije prema aerobnoj glikolizi uz povećane nivoe mitohondrijskih reaktivnih kisikovih vrsta. Autori su tu promjenu direktno mjerili metaboličkim testovima Seahorse koji prate potrošnju kisika i ekstracelularno zakiseljavanje. Metilensko plavilo poništilo je i metaboličku promjenu i prekomjernu ekspresiju PHD3, smanjilo upalne faktore i smrt neurona te poboljšalo rezultate testova ponašanja. Pozitronska emisijska tomografija dodala je i slikovne podatke: lipopolisaharid je povećao unos glukoze u hipokampus na FDG-PET snimcima, a tretman ga je ponovo smanjio, što je u skladu s mirnijim upalnim metabolizmom u živom mozgu.

Ovo je bogatiji skup mjerenja nego u studiji s astrocitima (citokini, metabolizam, snimanje, ponašanje životinja), ali odnosi se na drugačiji okidač i drugačiju ćeliju. Čitaoci koji porede te dvije studije trebaju odvojiti okidače: jedna studija spašava potporne ćelije koje gladuju tokom oporavka, dok druga prigušuje lažnu uzbunu zbog infekcije u imunskim ćelijama.

Mikroglija pod mikroskopom: oblik kao pokazatelj

Treći eksperiment posmatra istu bakterijsku uzbunu samo kroz oblik ćelija. U glijalnim kulturama iz kore mozga štakora kontrolne mikroglijske ćelije obojene za marker IBA1 pokazuju brojne tanke nastavke, odnosno razgranati oblik karakterističan za nadzor. Nakon dvadeset četiri sata izlaganja lipopolisaharidu u koncentraciji od 10 mikrograma po mililitru, ćelije se spljošte u ameboidni oblik, a površina njihovog ćelijskog tijela raste dok obim ostaje približno nepromijenjen, što je geometrijski znak zaobljavanja. Metilensko plavilo u koncentraciji od 1 mikromolar, dato zajedno s toksinom, očuvalo je razgranate nastavke i održalo površinu i obim ćelijskog tijela blizu kontrolnih vrijednosti. Studija na kulturama ćelija štakora kvantificira ovo očuvanje oblika mjerenjima površine i obima ćelijskog tijela.

Dva detalja ovoj studiji daju veću vrijednost od obične slike. Prvo, spoj korišten za poređenje, menadion, još jedna redoks-aktivna molekula u istoj koncentraciji, nije očuvao oblik i sam je podsticao ćelije da poprime aktivirani oblik. Dakle, taj učinak nije opće svojstvo svih molekula koje učestvuju u redoks ciklusima. Drugo, autori povezuju učinak boje s aktivacijom Nrf2, transkripcijskog faktora koji upravlja programom antioksidativnih i protuupalnih gena, a ne samo s direktnim neutraliziranjem reaktivnih vrsta. Povezani prikazi redoks i upalne signalizacije stavljaju ovu vezu s Nrf2 u kontekst.

Oblik je ipak najslabiji od ova tri pokazatelja. Razgranata ćelija obično je ćelija koja nadzire, a zaobljena ćelija obično je aktivirana, ali morfologija je posredni pokazatelj, a ne transkript. Ova kultura nije sadržavala imunske ćelije porijeklom iz krvi, neuronske mreže niti je omogućavala mjerenje ponašanja.

Uporedno čitanje tri rezultata

Zajednički obrazac u redovima jeste da svaki okidač ima vlastito mjerenje i vlastiti odgovor. Metabolički oporavak odgovara na pitanje o metabolizmu. Podaci o citokinima i ponašanju odgovaraju na pitanje o upali. Oblik odgovara na pitanje o obliku. Nijedan od ta tri rezultata sam po sebi ne prelazi granice onoga što je mjereno.

Šta mikroglija koja izgleda mirnije ne dokazuje

Cijeloj ovoj temi potrebna je sljedeća rečenica: mikroglija koja izgleda manje aktivirano ili promijenjen metabolizam mikroglije sami po sebi ne dokazuju poboljšanu funkciju mozga.

Morfologija se može promijeniti bez odgovarajuće promjene funkcije. Ćelija može zadržati svoje ogranke, a ipak oslobađati citokine, ili se zaobliti dok korisno uklanja ćelijske ostatke. Metabolička mjerenja imaju isto ograničenje: zapis testa Seahorse ili PET snimak prikazuju korištenje energije, a ne kogniciju. Studija na miševima koja je povezala metaboličke pokazatelje i pokazatelje povezane s oblikom s testovima ponašanja snažnija je upravo zato što je objedinila više nivoa dokaza, umjesto da od jednog mjerenja očekuje da podupre cijeli zaključak. Čak i tu vrijede uobičajena ograničenja: lipopolisaharid modelira sterilnu uzbunu, a ne stvarnu infekciju, miševi nisu ljudi, a i sami autori ističu razlike među vrstama. Svako ko planira daljnji rad treba razmotriti kako se nalazi o mikrogliji prenose između modela prije nego što pretpostavi da se taj put ponaša identično u ljudskom tkivu.

Iz toga proizlazi praktična posljedica za vrijeme primjene. U eksperimentu s astrocitima rana primjena pogoršava ishod, dok primjena tokom oporavka poboljšava ishod. Rezultati s mikroglijom potiču iz primjene u vrijeme upalnog okidača. Povreda mozga u stvarnom životu istovremeno spaja obje faze: energetski poremećaj i imunsku uzbunu, koji se razvijaju tokom više sati. Eksperiment koji izolira jednu fazu ne može odrediti raspored primjene za kombinirani slučaj. Zato se u raspravama o vremenskim periodima primjene odvojeno razmatraju tok uskraćivanja i tok upale.

Pošten sažetak stane u jedan odlomak. U izoliranim astrocitima metilensko plavilo dato tokom reoksigenacije ponovo pokreće respiraciju i spašava ćelije. U mikrogliji izloženoj bakterijskom fragmentu ono poništava upalni metabolički program preko specifičnog puta PHD3 i čuva oblik mirovanja. Svaki rezultat je stvaran unutar svojih eksperimentalnih uslova, a nijedan nije opći sud o upali u mozgu. Poređenje glijalnih ćelija korisno je upravo zato što sprečava da se te dvije priče stope u jednu.