Objašnjenje Loefflerovog alkalnog i polihromnog metilenskog plavila

Tri boce mogu stajati jedna pored druge na radnom stolu za bojenje, a svaka je označena kao neka varijanta metilenskog plavila. Na jednoj piše vodeno metilensko plavilo 1%. Na drugoj piše Loefflerovo alkalno metilensko plavilo. Na trećoj piše polihromno metilensko plavilo. Zaposleni laboratorijski radnik posegne za onom koja mu je najbliža. Razmaz se zatim oboji preslabo, previše jednolično plavo ili neočekivanim nijansama ljubičaste, a krivica za rezultat pripiše se uzorku.

To je problem formulacije, a ne uzorka. Tri rastvora sadrže srodna bojila, ali se zasnivaju na različitim konceptima bojenja. Jedan je obično kationsko bojilo pri gotovo neutralnoj pH vrijednosti. Drugi je isto bojilo čije je djelovanje pojačano alkalijom. Treći više nije jedno bojilo, nego namjerno oksidirana smjesa. Ako upotrijebite pogrešan rastvor, princip bojenja mijenja se tokom rada.

Kratak odgovor

Obično vodeno metilensko plavilo je polazna osnova: približno 1% bojila u vodi, jednostavno kationsko bojilo za prikaz bakterijske morfologije i opću mikroskopiju. Loefflerovo alkalno metilensko plavilo nastaje dodavanjem male, odmjerene količine razrijeđene alkalije u alkoholni osnovni rastvor razrijeđen vodom, čime se povećava pH vrijednost i pojačava vezivanje kationskog bojila za kisele bakterijske strukture. Polihromno metilensko plavilo je metilensko plavilo koje je namjerno podvrgnuto sazrijevanju oksidacijom u alkalnoj sredini, pa boca sadrži smjesu demetiliranih homologa (azure A, azure B, azure C), tionina i metilenskog ljubičastog uz preostalo metilensko plavilo, a ta smjesa različite strukture boji različitim nijansama.

Ako zapamtite samo jednu rečenicu: alkalizacija mijenja intenzitet bojenja, dok polihromiranje mijenja boje koje se dobijaju bojenjem.

Obično vodeno metilensko plavilo: referentna tačka

Najjednostavnija formulacija je metilensko plavilo rastvoreno u vodi, obično u koncentraciji 1% w/v, bez alkalije i bez oksidacije. Obojena hemijska vrsta je metiltioninijev kation s hloridnim protuionom, malo, planarna fenotiazinska bojila koje je u PubChem zapisu o metilenskom plavilu opisano kao metiltioninijev hlorid. Kao kation, vezuje se za fosfatne okosnice nukleinskih kiselina i kisele grupe na bakterijskim ćelijskim zidovima, bojeći ćelije plavo na svijetloj pozadini.

Njegova prednost je predvidljivost. Jedra i bakterije izgledaju plavo. Kontrast je umjeren. Slabo uočljivi mikroorganizmi mogu se slabo obojiti, a upravo je to ograničenje koje je Loeffler nastojao prevazići. Za širu grupu jednostavnih bakterijskih bojila kojoj ovaj rastvor pripada pogledajte pregled jednostavnog bojenja bakterija. I ovdje je važno precizno razlikovati identitet bojila: metil plavilo je sasvim druga molekula, kao što objašnjava članak metil plavilo naspram metilenskog plavila, pa pretraga kataloga samo prema nazivu boje može dovesti do pogrešne klase bojila.

Loefflerovo alkalno metilensko plavilo: isto bojilo, snažnije djelovanje

Klasična Loefflerova receptura spaja alkoholni osnovni rastvor metilenskog plavila s razrijeđenom alkalijom u vodi. Udžbeničke verzije navode 0.3 g bojila u 30 mL 95% etanola uz 100 mL 0.01% vodenog rastvora kalijevog hidroksida (ili, ekvivalentno, 30 mL zasićenog alkoholnog rastvora metilenskog plavila, 100 mL destilirane vode i 1 mL 1% KOH), čime se dobija radni rastvor s približno 0.3% bojila pri izrazito alkalnoj pH vrijednosti. Komercijalne verzije slijede isti princip, a Thermo Fisher katalog mikrobioloških bojila navodi Loefflerovo alkalno metilensko plavilo uz polihromnu i vodenu varijantu kao zasebne kataloške artikle s različitim predviđenim namjenama.

Ključ je u alkaliji. Povećanje pH vrijednosti deprotonira karboksilne i fosfatne grupe u preparatu, povećavajući gustoću negativno nabijenih mjesta, dok alkoholni osnovni rastvor održava bojilo potpuno rastvorenim kako bi do tih mjesta stiglo u monomernom obliku. Rezultat je brže i intenzivnije bojenje bakterija nego neutralnim vodenim bojilom, uz prepoznatljive tamnoplave štapiće i koke rutinskog bakteriološkog razmaza. Bojenje obično traje jednu do tri minute, nakon čega slijedi ispiranje vodom.

Klasična primjena je Corynebacterium diphtheriae uzgojen na Loefflerovoj serumskoj podlozi: tanki, često batinasti štapići s intenzivno obojenim metahromatskim Babes-Ernstovim granulama pohranjenog polifosfata. Povezanost podloge i bojila je historijska, oba se pripisuju istom bakteriologu, a kontrast granula predstavlja dijagnostičku prednost. Osim u radu s difterijom, ovo bojilo služi kao opće bakteriološko bojilo za razmaze iz kultura, za prikaz morfologije bakterija roda Neisseria u kliničkim razmazima i svuda gdje bojenje po Gramu nije potrebno, ali obično vodeno plavilo daje preslab rezultat. To je monohromno bojilo. Sve kisele strukture poprimaju neku nijansu plave. Kada protokol zahtijeva razlikovanje pomoću boja, sama alkalija to ne može omogućiti.

Jedna praktična napomena: alkalni rastvori bojila propadaju i stvaraju talog tokom skladištenja i apsorpcije ugljendioksida. Laboratorije zato pripremaju umjerene količine ili kupuju kataloški rastvor i poštuju njegov rok trajanja, umjesto da nastavljaju koristiti staru bocu iz koje se talog sada nanosi na svako predmetno stakalce.

Polihromno metilensko plavilo: jedan naziv, više bojila

Polihromno metilensko plavilo polazi od istog bojila, ali ga podvrgava kontroliranoj oksidaciji u alkalnoj sredini, historijski nazvanoj sazrijevanje ili polihromiranje. Starenje u alkalnoj sredini, zagrijavanje s karbonatom ili oksidacija sredstvima poput dihromata postepeno uklanjaju metilne grupe s dimetilamino supstituenata. Proizvod je smjesa: preostalo metilensko plavilo uz azure B (uklonjena jedna metilna grupa), azure A i azure C (daljnja demetilacija), tionin (potpuno demetiliran) i oksidacijski nusproizvodi iz grupe metilenskog ljubičastog. Svaka komponenta ima vlastitu nijansu i afinitet prema tkivima, pa smjesa boji metahromatski: jedra, granule, mucini i hrskavica poprimaju različite tonove od plave do crvenoljubičaste.

To je ista hemija na kojoj se zasnivaju poznata bojila za krv. Rani istraživači utvrdili su da alkalizirano metilensko plavilo boji jedra parazita malarije u ljubičaste nijanse, ali su njihovi vodeni rastvori nakon sazrijevanja bili nestabilni i stvarali talog u roku od nekoliko dana. Pregled kako je izumljeno ljubičasto bojilo za krv prati kako su Malachowski i Romanowsky nezavisno iskoristili ovaj efekt 1891, kako je uveden metanol radi stabilizacije taloga bojila i fiksiranja razmaza bez zagrijavanja te kako je Giemsa kasnije standardizirao smjesu na osnovu odmjerenog azure B i eozina, uz stabilizaciju glicerolom. Savremena bojila tipa Giemsa direktno potječu od polihromnog metilenskog plavila s eozinom, kombinacije koja stvara Romanowskyjev efekt. Za detalje o kombiniranju s eozinom i komponenti azure B pogledajte bojila tipa Romanowsky i interakciju azure B s eozinom.

Budući da je smjesa, polihromno metilensko plavilo je po svojoj prirodi najmanje standardizirano od ova tri bojila. Njegov tačan odnos nijansi zavisi od postupka i stepena oksidacije, zbog čega ga dobavljači za histologiju prodaju kao zaseban proizvod s vlastitim ispitivanjima performansi, a ne kao odležalo Loefflerovo bojilo. Tipične primjene uključuju metahromatski prikaz granula mastocita, mucina i hrskavice, detalja plazma ćelija te Helicobacter pylori u tkivnim presjecima polihromnim metodama tipa Goodpasture. To je pravi izbor kada je cilj razlikovanje pomoću boja, a pogrešan kada protokol očekuje jasnu monohromnu bakterijsku siluetu.

Poređenje formulacija i namjena

Tabelu koristite kao vodič za donošenje odluke. Ako se preparat boji preslabo, promijenite pristup pH vrijednosti i posegnite za Loefflerovim bojilom. Ako se sve oboji, ali se ništa međusobno ne razlikuje, promijenite pristup bojilu i posegnite za polihromnim. Ako Loefflerov razmaz lijepo prikazuje granule, ali nadređeni pita zašto su jedra i citoplazma iste plave boje, odgovor je da nijedno alkalno monohromno bojilo ne može obaviti taj zadatak. To je pitanje za polihromnu grupu i njene derivate za bojenje krvi.

Izbjegavanje uobičajenih zabuna

Dvije greške uzrokuju većinu zabuna. Prva je pretpostavka da je Loefflerovo bojilo zamjenjivo s običnim metilenskim plavilom zato što oba u boci izgledaju plavo. Razlikuju se po pH vrijednosti i intenzitetu, a zamjena Loefflerovog bojila neutralnim tamo gdje je ono izričito navedeno gubi upravo kontrast granula na kojem je protokol zasnovan. Druga je smatrati svako staro ili slučajno odležalo alkalno plavilo polihromnim. Nekontrolirano starenje stvara nepoznatu smjesu nepoznate koncentracije, dok se pravi polihromni rastvori pripremaju definiranim postupcima oksidacije i, u grupi bojila za krv, kombiniraju s odmjerenim eozinom. Historija je ovdje poučna: nestabilne vodene rastvore nakon sazrijevanja iz 1890-ih zamijenile su stabilizirane metanolne formulacije upravo zato što se nekontrolirane smjese nisu mogle reproducirati. Tu lekciju vrijedi imati na umu prije bojenja dijagnostičkog preparata iz boce nepoznate starosti.

Preciznost u nazivima zaokružuje postupak. Provjerite kataloški artikl (vodeno, Loefflerovo ili polihromno), sadržaj bojila i predviđenu primjenu na etiketi, umjesto da zaključujete prema boji. Tri formulacije imaju zajednički izvorni hromofor. Nemaju zajedničku namjenu.