Jednostavno bojenje metilenskim plavilom naspram bojenja po Gramu: šta svaka metoda može dokazati

Student priprema razmaz iz kulture označene kao E. coli, prelijeva ga metilenskim plavilom na jednu minutu, ispire i posmatra kroz imerzioni objektiv. Plavi štapići prekrivaju vidno polje. U laboratorijskom izvještaju piše: "Gram-negativni štapići identificirani kao E. coli." Zapažanje je tačno. Zaključak nije potkrijepljen tim preparatom.

Greška je konceptualna, a ne tehnička. Student je jednostavno bojenje tretirao kao diferencijalni test. Jednostavno bojenje i bojenje po Gramu odgovaraju na različita pitanja jer se zasnivaju na različitim principima bojenja. Jedno pita: koji je oblik prisutan. Drugo pita: kako se ćelijski zid ponaša kada se podvrgne testu. Ako ih zamijenite, pravilno obojen preparat dovodi do neopravdanog izvještaja.

Ovo poređenje razdvaja dvije metode, pokazuje koje tvrdnje svaki rezultat opravdava i odgovara na dva pitanja koja studenti najčešće postavljaju: može li se metilensko plavilo koristiti u bojenju po Gramu i šta bojenje E. coli metilenskim plavilom zaista pokazuje.

Kratak odgovor

Jednostavno bojenje metilenskim plavilom boji svaku ćeliju koja se može obojiti istom plavom bojom, pa otkriva morfologiju (štapiće, kugle, spirale) i raspored (pojedinačno, u parovima, u lancima), ali ništa o kategoriji prema Gramu. Bojenje po Gramu dodaje jod, korak odbojavanja i kontrastnu boju, pa razdvaja bakterije na Gram-pozitivne (ljubičaste) i Gram-negativne (ružičaste ili crvene) prema tome kako njihovi omotači zadržavaju boju. Plavi štapići nakon bojenja metilenskim plavilom znače "prisutne su ćelije štapićastog oblika". Ružičasti štapići nakon potpunog postupka bojenja po Gramu znače "prisutni su Gram-negativni štapići". Druga tvrdnja je snažnija jer je postupak uključivao dodatni test.

Za širu grupu metoda bojenja bakterija jednom bojom kojoj pripada ovaj članak pogledajte atlas bojenja u mikroskopiji.

Jednostavno bojenje: jedna boja, jedno pitanje

Metilensko plavilo je bazna (kationska) boja. Njegov obojeni ion nosi pozitivan naboj i veže se za negativno nabijene strukture u ćeliji, uključujući nukleinske kiseline i kisele površinske grupe, pa ćelije izgledaju plavo na svijetloj pozadini. OpenStax opisuje ovaj princip pozitivnog bojenja u svom poglavlju o bojenju. Sam kation boje je mali, pljosnati fenotiazinski ion detaljno opisan u referentnom članku o hemiji metilenskog plavila; hloridni protuion ne daje boju.

Standardni nastavni protokol namjerno je jednostavan: napravite tanak razmaz, osušite ga na zraku, fiksirajte toplotom, prelijte približno 1% vodenom otopinom metilenskog plavila na otprilike jednu minutu, nježno isperite vodom, osušite upijanjem i pregledajte uz uljnu imerziju. Nastavni protokol na LibreTexts navodi upravo ovaj postupak s 1% otopinom u trajanju od jedne minute, uz napomenu da neke laboratorije produžavaju vrijeme. Nema mordanta, nema sredstva za odbojavanje, nema druge boje. Upravo je to suština. Sa samo jednom bojom i bez selektivnog uklanjanja, svaka ćelija koja veže boju na kraju ima istu boju.

Kod E. coli očekivano vidno polje sadrži plave štapiće (bacile), pojedinačno, u parovima ili manjim grupama. Plava boja potiče od boje za bojenje. Štapićasti oblik potiče od organizma. Međutim, ta kombinacija ne identificira organizam, jer su mnoge vrste štapićaste i mnogi se štapići pri jednostavnom bojenju oboje plavo. ATCC u svom vodiču za mikrobiološke kulture izričito navodi ovo ograničenje na morfologiju. Ispravan izvještaj glasi: "uočeni su plavi bacili". Za sve što nadilazi oblik i raspored potrebno je više dokaza.

Bojenje po Gramu: četiri reagensa, jedan test ponašanja

Bojenje po Gramu je diferencijalno bojenje. Sve ćelije podvrgava istom slijedu koraka i pokazuje koje ćelije zadržavaju prvu boju, a koje je gube. Protokoli Američkog društva za mikrobiologiju za bojenje po Gramu definiraju standardni redoslijed od četiri koraka: kristal violet (primarna boja), Gramov jod (mordant), alkohol ili smjesa acetona i alkohola (sredstvo za odbojavanje), zatim safranin (kontrastna boja).

Standardni nastavni model objašnjava ovu razliku strukturom ćelijskog omotača. Gram-pozitivne ćelije imaju debeo peptidoglikanski zid koji dehidrira i zadržava kompleks kristal violeta i joda tokom ispiranja alkoholom. Gram-negativne ćelije imaju tanak peptidoglikanski sloj i vanjsku membranu bogatu lipidima koju sredstvo za odbojavanje narušava, pa se kompleks ispire, a ćelije zatim primaju safranin. Pregled bojenja po Gramu na NCBI Bookshelf daje ovo objašnjenje zasnovano na ćelijskom zidu. Stručnjaci dodaju da je cjelokupna fizikalna hemija složenija od same debljine zida, ali pri tumačenju u laboratoriji vrijedi pravilo ponašanja: ljubičasto znači da je boja zadržana, a ružičasto da je izgubljena i zatim zamijenjena kontrastnom bojom.

Ilustrativni prikazi. Stilizirani crteži za poređenje metoda, nisu mikrografije snimljene kamerom. Boje su pojednostavljene radi objašnjavanja principa: jedna boja pri jednostavnom bojenju, dvije boje nakon odbojavanja po Gramu.

Može li se metilensko plavilo koristiti u bojenju po Gramu

Ovo pitanje ima dva značenja, a ona zahtijevaju različite odgovore.

Prvo značenje: može li jedno prelijevanje metilenskim plavilom zamijeniti cijeli postupak bojenja po Gramu. Ne. Bez joda, sredstva za odbojavanje i kontrastne boje nema diferencijalnog koraka, pa se ne ispituje kategorija prema Gramu. Plavo vidno polje nakon upotrebe samo metilenskog plavila rezultat je jednostavnog bojenja, čak i ako bočica stoji pored reagensa za bojenje po Gramu. Nemojte ga bilježiti kao rezultat bojenja po Gramu.

Drugo značenje: može li metilensko plavilo zamijeniti safranin kao kontrastna boja u koraku 4. Funkcionalno može obojiti odbojene ćelije, a udžbenička vježba predviđa ljubičaste Gram-pozitivne ćelije i plave Gram-negativne ćelije nakon takve zamjene. Logika je ispravna jer su pravilno odbojene Gram-negativne ćelije gotovo bezbojne i primit će drugu kationsku boju. Međutim, to nije standardni protokol. Protokoli ASM-a propisuju safranin, uz priznate alternative kao što je bazni fuksin u nekim varijantama, ali ne metilensko plavilo. Postoji i praktičan nedostatak: plavu je teže razlikovati od ljubičaste nego ružičastu od ljubičaste, naročito početnicima i naročito pod istrošenim mikroskopskim lampama. Za nastavne vježbe i svaki rezultat koji je važan koristite kontrastnu boju navedenu u protokolu, obično safranin, a metilensko plavilo kao kontrastnu boju tretirajte kao demonstracijsku varijantu, a ne kao ekvivalentan standard.

Srodno pitanje o tome kako se metilensko plavilo poredi s drugim opcijama bojenja jednom bojom obrađeno je u poređenju jednostavnih bojenja bakterija.

Šta bojenje E. coli metilenskim plavilom dokazuje, a šta ne

E. coli je Gram-negativni štapić, ali ta rečenica objedinjuje činjenice iz više metoda: morfologiju iz mikroskopije, reakciju po Gramu iz bojenja po Gramu i identitet iz uzgoja kulture uz biohemijsko ili molekularno testiranje. Razmaz obojen metilenskim plavilom doprinosi samo prvom dijelu. Utvrđuje da su u obojenom uzorku prisutne ćelije štapićastog oblika i pokazuje kako su raspoređene. Ne utvrđuje reakciju po Gramu jer nije proveden test odbojavanja. Ne identificira vrstu jer štapići mnogih vrsta izgledaju slično pri ovoj rezoluciji.

Ovdje izvještaji griješe na predvidljiv način. Autor u zapis zapažanja unosi prethodno znanje ("ova kultura bi trebala biti E. coli, a E. coli je Gram-negativna"), pa izgleda kao da preparat potvrđuje ono što je zapravo pretpostavljeno. Jasniji izvještaj razdvaja te nivoe: "Jednostavno bojenje metilenskim plavilom: uočeni su plavi bacili; samo morfologija, kategorija prema Gramu nije ispitana." Zatim, ako je bojenje po Gramu pravilno provedeno uz kontrole: "Bojenje po Gramu: ružičasti štapići, u skladu s Gram-negativnom reakcijom." Identitet vrste utvrđuje se kasnije, kroz postupak identifikacije, a ne samo na osnovu boje.

Praktični vodič za tumačenje

Koristite ovo pravilo odlučivanja za laboratorijskim stolom. Ako su sve ćelije iste boje, a protokol je koristio jednu boju bez sredstva za odbojavanje, proveli ste jednostavno bojenje. Navedite oblik, procjenu veličine i raspored. Tu se zaustavite. Ako je protokol uključivao kristal violet, jod, sredstvo za odbojavanje i kontrastnu boju uz poznate pozitivne i negativne kontrole, proveli ste bojenje po Gramu. Navedite boju i morfologiju: ljubičaste koke u lancima, ružičasti štapići i slično.

Tri greške uzrokuju većinu zabuna. Prva je pretjerano tumačenje plavih štapića kao potvrde E. coli. Druga je evidentiranje preparata obojenog metilenskim plavilom pod naslovom "Bojenje po Gramu" u bilježnici, što će kasniji čitaoci pogrešno protumačiti. Treća je proizvoljno mijenjanje kontrastnih boja i zatim poređenje boja između laboratorija kao da su korištene iste boje. Svaka greška ima isto rješenje: navedite metodu koja je zaista provedena i tvrdite samo ono što ta metoda ispituje.

Jednostavno bojenje ima svoje mjesto upravo zato što opravdava ograničene tvrdnje. Brzo je, tolerira manja odstupanja i dovoljno je kada je pitanje morfologija: ima li nečega i kakvog je oblika. Kada je pitanje klasifikacija, provedite diferencijalni test. Plavi preparat govori kako ćelije izgledaju. Ljubičasti ili ružičasti preparat govori kako se njihovi zidovi ponašaju. Nijedan preparat sam za sebe ne otkriva vrstu.