Bojenje ćelija obraza metilenskim plavim: šta posmatrati

Učenica stavlja kap suspenzije ćelija obraza na predmetno stakalce, pogleda kroz mikroskop i ne vidi gotovo ništa. Nekoliko blijedih obrisa nalik sjenama promiče kroz svijetlo vidno polje. Pokušava izoštriti sliku, zatim pojačava osvjetljenje i na kraju zaključuje da je stakalce prazno. Stakalce nije prazno. Ćelije su tu. Gotovo su prozirne, a upravo je prozirnost problem koji ovo bojenje treba riješiti.

Taj nesklad između očekivanja i slike vrijedi objasniti prije početka protokola. Početnici očekuju da mikroskop otkrije detalje onako kako zumiranje kamerom otkriva udaljeni natpis. Mikroskop sa svijetlim poljem radi nešto uže: prikazuje razlike u apsorpciji svjetlosti. Neobojena ćelija obraza gotovo uopće ne apsorbira svjetlost, pa gotovo i ne stvara razliku. Metilensko plavo dodaje tu razliku. Neravnomjerno se veže unutar ćelije i pretvara strukturu u kontrast. Kada učenici shvate taj koncept, svaki naredni korak postaje razumljiva posljedica, a ne puki recept.

Ovdje pomaže osnovno objašnjenje kako jednostavna bojenja povećavaju kontrast u školskom laboratoriju, a podsjetnik na podešavanje mikroskopa sa svijetlim poljem prije bojenja sprečava polovinu neuspjelih preparata. Hemija koja stoji iza boje obrađena je u uvodu u metilensko plavo u mikroskopiji, koji objašnjava zašto se upravo ova boja stalno pojavljuje na laboratorijskom stolu.

Protokol za nastavu

Verzija s vlažnim preparatom opisana u nastavku jednostavniji je osnovni izbor za opću nastavu. Ne zahtijeva plamen ni korak fiksacije. Varijanta s fiksiranim razmazom, koja se koristi u nekim visokoškolskim priručnicima, uključuje sušenje na zraku i kratku fiksaciju toplotom, kao u vježbi s razmazom ćelija obraza ustanove North Central Texas College, objavljenoj na platformi Biology LibreTexts, ali fiksacija toplotom uobičajena je praksa u mikrobiologiji, a ne uslov za posmatranje epitelnih ćelija.

Potrebno je: čista predmetna i pokrovna stakalca, sterilni štapići s vatom za jednokratnu upotrebu (preporučeni) ili nove pljosnate čačkalice, bočica s kapaljkom koja sadrži 0.5 do 1 posto vodene otopine metilenskog plavog, destilirana ili deionizirana voda, upijajući papir, rukavice i složeni mikroskop s ukupnim povećanjem od 100x i 400x.

1. Isperite usta običnom vodom. Time se uklanjaju čestice hrane koje se kasnije intenzivno boje i odvlače pažnju od ćelija.
2. Svaki učenik uzima uzorak samo sa svog obraza. Svježim sterilnim štapićem nježno protrljajte unutrašnju stranu obraza. Pritisnite, nemojte strugati. Prestanite mnogo prije nego što se pojavi bilo kakva nelagoda ili krvarenje.
3. Valjajte štapić preko sredine čistog predmetnog stakalca tako da ostavite tanak sloj. Tanak sloj najvažniji je pojedinačni faktor za dobivanje preglednog preparata. Debela bijela naslaga nakon bojenja postat će nepregledna plava masa.
4. Dodajte jednu kap metilenskog plavog preko razmaza. Ostavite da djeluje 1 do 3 minute. Jedna minuta dovoljna je u mnogim visokoškolskim protokolima; NCERT-ov priručnik za laboratorijsku nastavu prirodnih nauka za IX razred za privremeni preparat predviđa oko 3 minute. Duže nije bolje, a pretjerano bojenje najčešća je greška u određivanju trajanja.
5. Nježno isperite destiliranom vodom ili upijajućim papirom uklonite višak boje, prema lokalnom protokolu. Pozadina treba postati blijedoplava, a ne tamnoplava.
6. Spustite pokrovno stakalce pod uglom tako da prvo dodirne jednom ivicom, a zatim ga polako pustite da se spusti. Time se sprečava stvaranje mjehurića zraka.
7. Počnite s malim povećanjem kako biste pronašli ćelije, provjerite izoštrenost i centriranje, zatim pređite na 100x i na kraju na 400x. Pri 400x koristite samo fino podešavanje fokusa.

Koncentracija boje zaslužuje jednu preciznu rečenicu. Školski protokoli uglavnom koriste vodenu otopinu metilenskog plavog koncentracije oko 1 posto. Koncentriranija osnovna otopina ili dugo izlaganje brže potamnjuju pozadinu nego jedro, čime se preokreće kontrast na kojem se vježba zasniva.

Sigurno rukovanje materijalom s obraza

Uzorci s obraza sadrže pljuvačku i uobičajene mikroorganizme usne šupljine, pa svaki svježi razmaz tretirajte kao potencijalno zarazan materijal, iako su davaoci zdravi učenici iz razreda. Smjernice Američkog društva za mikrobiologiju o biološkoj sigurnosti u nastavnim laboratorijima navode opća načela: procijenite rizik prije časa, nosite rukavice, zaštitite oči kada postoji mogućnost prskanja, nakon rada operite ruke, dezinficirajte radne površine i odložite kontaminirani materijal za jednokratnu upotrebu prema odobrenom postupku za biološki otpad.

Četiri pravila za nastavu pokrivaju većinu rizika. Jedan davalac po štapiću i po predmetnom stakalcu, bez dijeljenja. Uzorak se uzima samo od sebe, nikada od učenika do sebe. Štapići i čačkalice za jednokratnu upotrebu odlažu se direktno u predviđeni spremnik za otpad, nikada nazad na radnu površinu. Samo metilensko plavo ostavlja mrlje na koži i odjeći i nadražuje oči, pa su potrebne rukavice i uobičajene higijenske mjere pri radu s bojama. Nemojte proširivati ovu vježbu na uzgoj bilo čega iz razmaza i nemojte improvizirati fiksaciju svježeg ljudskog materijala toplotom izvan školskog sigurnosnog postupka.

Šta posmatrati i zašto tako izgleda

Pri 100x tražite široke, pljosnate, blijedoplave ćelije nepravilnih ovalnih ili poligonalnih obrisa. Nalaze se pojedinačno ili u labavim slojevima koji se preklapaju. Svaka ćelija obično ima jednu tamniju plavu tačku. Ta tačka je jedro. Obratite pažnju i na raspored: pločaste epitelne ćelije nalik su tankim pločicama, a ne kuglama, zbog čega njihove ivice više liče na ispucalu glazuru nego na okrugle balone.

Pri 400x jasno se razaznaju tri obilježja. Granica ćelije pojavljuje se kao tanka, tamnija linija koja je okružuje. Citoplazma ispunjava unutrašnjost svijetlom, ravnomjernom plavom bojom. Jedro je tamnije i zbijenije, često ovalno, obično blizu sredine, ali ne uvijek. Zatražite od učenika da zabilježe sva tri obilježja, oblik i povećanje, jer radni list traži upravo to.

Ovdje je važna jedna napomena o tačnosti, koju mnogi radni listovi pogrešno prikazuju. Vidljiva granica odgovara području plazmatske membrane, ali sama membrana, lipidni dvosloj debljine približno 7 do 10 nanometara, daleko je ispod granice razlučivanja školskog mikroskopa. Učenici vide optičku ivicu ćelije i boju nakupljenu na tom mjestu. Isti oprez vrijedi i za organele. Mitohondrije, endoplazmatski retikulum, Golgijeva tjelešca i ribosomi nisu vidljivi u ovom preparatu. Konvencionalni svjetlosni mikroskop u dobrim uslovima može razlučiti detalje veličine približno 0.2 mikrometra, kako objašnjava NCBI-jev pregled mikroskopskih alata u ćelijskoj biologiji, a većina ultrastrukture nalazi se ispod te granice ili blizu nje. Veće prazno povećanje uvećava sliku bez dodavanja detalja.

Zašto se jedro boji najtamnije? Metilensko plavo je kationska boja, pozitivno nabijena u otopini, i povezuje se s negativno nabijenim materijalom u ćeliji, prvenstveno s nukleinskim kiselinama. Hromatin koncentrira DNA u jedru, pa se u jedru nakuplja najviše boje. Citoplazma sadrži RNA i druge nabijene molekule, pa se i ona boji, ali raspršenije i svjetlije. Ključna napomena: metilensko plavo nije boja specifična za DNA. Rad o raspodjeli metilenskog plavog pri snimanju jedara opisuje povezivanje kationa s područjima bogatim nukleinskim kiselinama, a starije kvantitativno istraživanje o vezivanju metilenskog plavog u ćelijskim preparatima pokazalo je da je većina vezane boje povezana s nukleinskim kiselinama. Tamno jedro uz svijetlu citoplazmu zato predstavlja obrazac kontrasta, a ne molekularni test.

Greške koje će učenici praviti i kako ih prepoznati

Gotovo svaki neuspjeli preparat pripada jednom od pet obrazaca. Naučite učenike da utvrde uzrok problema s preparatom umjesto da ga naslijepo ponavljaju.

Pretjerano bojenje čini ćelije i pozadinu jednoliko tamnim, pa se jedro gubi u vidnom polju. Ispravite to kraćim vremenom bojenja ili temeljitijim ispiranjem. Nedovoljno bojenje ostavlja blijede obrise koji nestaju kada se pojača osvjetljenje; produžavajte vrijeme u koracima od trideset sekundi. Debeli razmazi stvaraju guste mase ćelija koje se preklapaju, u kojima se nijedan obris ne može pratiti; rješenje je mehaničko, sljedeći put razmažite tanje, jer nikakvo ispiranje ne može popraviti gomilu ćelija. Mjehurići zraka pojavljuju se kao savršeni krugovi s oštrim tamnim rubovima i odvlače pažnju početnika koji ih zamjenjuju za strukture; ponovo polako postavite pokrovno stakalce pod uglom. Sitne tamne tačke rasute po ćelijama ili oko njih obično su uobičajene bakterije usne šupljine, kako navode školski protokoli poput postupka za ćelije obraza na stranici Ingrid Science. One potvrđuju da je usna šupljina nastanjena mikroorganizmima, što učenicima može ostati u sjećanju, ali u ovoj vježbi nije moguće odrediti kojoj vrsti pripadaju i ne treba ih crtati kao dijelove ćelije. Ostaci hrane i niti sluzi boje se nepravilno i intenzivno; prethodno ispiranje služi tome da ih bude manje.

Šta ova vježba ne može pokazati

Ovo je posmatranje u obrazovne svrhe, a ne dijagnostički test. Na osnovu izgleda ćelija u preparatu obojenom u nastavi ne može se dijagnosticirati infekcija, rak niti bilo koja bolest, i članak ne treba tumačiti kao da sugerira suprotno. Preparat prikazuje oblik, granicu, citoplazmu i jedro pri dva povećanja. Ne prikazuje ultrastrukturu membrane, detalje organela ni molekularni identitet. Jasno navođenje ovog ograničenja štiti i nauku i učenike: dobar rezultat je pravilno označen crtež sa zabilježenim povećanjem i korištenom bojom, a ne zaključak o zdravlju.

Radni list za učenike i označene mikrografije

Dva pripremljena materijala za ovu stranicu jesu označena mikrografija iznad i radni list ispod. Odštampajte po jedan radni list za svakog učenika ili ga projicirajte i zatražite od učenika da precrtaju okvire u sveske.

Kako ga koristiti tokom časa od 45 minuta: deset minuta za sigurnosne upute i uzimanje uzoraka, deset minuta za bojenje i postavljanje pokrovnog stakalca, petnaest minuta za posmatranje i skiciranje pri oba povećanja, deset minuta za kontrolnu listu i poređenje s označenom mikrografijom. Stavke kontrolne liste namjerno su konkretne i proceduralne. Tanak razmaz, odgovarajuće vrijeme bojenja, jedro tamnije od citoplazme, zabilježeno povećanje. Učenik koji može označiti sve četiri stavke razumio je koncept koji ova lekcija treba prenijeti: mikroskopi prikazuju razlike, a bojenja stvaraju razlike koje vrijedi prikazati.