মিথিলিন ব্লু ও ভিটামিন C: দ্রবণ কেন স্বচ্ছ হয়ে যেতে পারে

আপনি নীল মিথিলিন ব্লু দ্রবণের একটি গ্লাসে ভিটামিন C ট্যাবলেট যোগ করে নাড়লেন এবং দেখলেন নীল রং ধীরে ধীরে ফিকে হয়ে যাচ্ছে। এক minute পর তরলটি সাধারণ পানির মতো দেখায়। তখন সহজেই মনে হতে পারে যে ভিটামিন C রঞ্জকটিকে ধ্বংস বা নিরপেক্ষ করে দিয়েছে।

এই ধারণাটি ভুল, এবং ভুলটি গুরুত্বপূর্ণ। এখানে যা দেখা যাচ্ছে তা ধ্বংস নয়, বরং জারণ অবস্থার একটি প্রত্যাবর্তনযোগ্য পরিবর্তন। রঞ্জকটি এখনও সেখানে আছে। উপযুক্ত অবস্থায় এটি আবার ফিরে আসে।

রঞ্জকের দুটি অবস্থা

মিথিলিন ব্লুর দুটি সুপরিচিত অবস্থা রয়েছে। জারিত রূপটি, যা সাধারণত MB+ হিসেবে লেখা হয়, একটি বিস্তৃত সংযুগ্ম রিং ব্যবস্থা ধারণ করে যা 664 nm-এর কাছাকাছি আলো প্রবলভাবে শোষণ করে। এই শোষণই নীল রঙের কারণ। বিজারিত রূপ, লিউকোমিথিলিন ব্লু (LMB), সেই শক্তিশালী দৃশ্যমান ব্যান্ডটি হারায়, তাই পাতলা দ্রবণটি বর্ণহীন দেখায়।

রঞ্জকটিকে একটি ছোট পুনরায় চার্জযোগ্য ইলেকট্রন ভাণ্ডার হিসেবে ভাবুন। ইলেকট্রন ও একটি প্রোটন দিয়ে এটিকে চার্জ করলে রং মিলিয়ে যায়। সেই ইলেকট্রনগুলো সরিয়ে নিলে রং ফিরে আসে:

MB+ + H+ + 2e- to LMB (colorless)

ভিটামিন C এই চার্জ সরবরাহ করে। অ্যাসকরবেট ডিহাইড্রোঅ্যাসকরবেটের দিকে জারিত হয় এবং দুটি reducing equivalents দান করে, তাই আদর্শ হিসাব অনুযায়ী এক mole অ্যাসকরবেট প্রায় এক mole MB+ বিজারিত করে। বাস্তব বেঞ্চ-টপ দ্রবণে হিসাবটি আরও জটিল, কারণ দ্রবীভূত অক্সিজেন একই ইলেকট্রনের জন্য প্রতিযোগিতা করে। এ কারণেই দ্রবণকে স্বচ্ছ অবস্থায় রাখতে সাধারণত অতিরিক্ত অ্যাসকরবেট দরকার হয়।

প্রক্রিয়াটি একটি পরিষ্কার two electron ধাপেই সম্পন্ন হতে হবে এমন নয়। র‍্যাডিক্যাল ও আংশিক বিজারিত মধ্যবর্তী পদার্থ এতে অংশ নেয়, এবং দ্রাবক, অম্লতা ও ঘনত্ব অনুযায়ী সুনির্দিষ্ট পথ বদলে যায়। তবে শেষ অবস্থা একই থাকে। নীল MB+ বর্ণহীন LMB-তে পরিণত হয় এবং এই প্রক্রিয়ায় ভিটামিন C ব্যবহৃত হয়।

ঝাঁকালে নীল রং কেন ফিরে আসে

এই পরীক্ষার প্রচলিত শ্রেণিকক্ষ সংস্করণে দ্বিতীয় একটি ধাপ রয়েছে। স্বচ্ছ ভায়ালটি স্থির রেখে দিলে এটি স্বচ্ছই থাকে। ঝাঁকালে নীল রং ফিরে আসে। অপেক্ষা করলে আবার ফিকে হয়ে যায়।

রং ফিরিয়ে আনে অক্সিজেন। দ্রবীভূত O2 LMB-কে আবার MB+-এর দিকে জারিত করে, তাই ঝাঁকানো রঞ্জকটিকে সক্রিয় করে না। বরং এটি উপরের ফাঁকা স্থানের বাতাসকে তরলে মিশিয়ে দ্রবীভূত অক্সিজেন পুনরায় সরবরাহ করে, ফলে বিপরীত বিক্রিয়া দ্রুত হয়। যতক্ষণ অতিরিক্ত অ্যাসকরবেট থাকে, পুনর্গঠিত MB+ আবার বিজারিত হয়। ফলে পরিচিত চক্রটি দেখা যায়: স্থির অবস্থায় বর্ণহীন, ঝাঁকালে নীল, অপেক্ষা করলে আবার বর্ণহীন। অ্যাসকরবেট শেষ হয়ে গেলে অক্সিজেন স্থায়ীভাবে প্রাধান্য পায় এবং দ্রবণ নীলই থাকে।

এ কারণেই methylene blue vitamin c প্রদর্শনটি পাত্রের জ্যামিতির প্রতি সংবেদনশীল। অল্প headspace-সহ বন্ধ cuvette একটি চওড়া beaker-এর তুলনায় বেশি সময় স্বচ্ছ থাকে। জোরে aeration করলে স্বচ্ছ পর্যায়টি ছোট হয়। তাই যে কেউ পরীক্ষাটি রিপোর্ট করলে শুধু বিকারকের পরিমাণ নয়, অক্সিজেনের অবস্থাও উল্লেখ করা উচিত।

নিয়ন্ত্রিত প্রদর্শন ও এর শর্তাবলি

এই নিবন্ধের কভার ছবিতে প্রত্যাশিত তুলনাটি দেখানো হয়েছে: অভিন্ন আলোতে একটি নীল MB+ control-এর পাশে অ্যাসকরবেট দ্বারা বিজারিত LMB নমুনা। ফলাফল পুনরুৎপাদনযোগ্য করতে বিক্রিয়ার হার পরিবর্তন করে এমন প্রতিটি চলক স্থির রাখুন:

দুটি ভায়ালেরই নির্দিষ্ট সময়ে ছবি তুলুন, যেমন 0, 1, 5, and 15 minutes, তারপর ঝাঁকিয়ে আবার ছবি তুলুন। nitrogen purged ভায়ালটি সবচেয়ে বেশি সময় স্বচ্ছ থাকা উচিত। aerated ভায়ালটি ঝাঁকানোর পর দ্রুত আবার নীল হওয়া উচিত। ঝাঁকানো ও aeration করার পরও যদি কোনো নমুনা কখনো আবার নীল না হয়, তাহলে সাধারণ বিজারণের পরিবর্তে অপরিবর্তনীয় অবক্ষয়ের সম্ভাবনা বিবেচনা করুন।

ফর্মুলেটররা বৃহত্তর স্কেলেও একই যুক্তি ব্যবহার করেন। কোনো মিশ্রণে মিথিলিন ব্লু কীভাবে আচরণ করবে তা সম্পূর্ণ রেডক্স ও formulation context-এর ওপর নির্ভর করে, এবং stability testing-এ রঙের পর্যবেক্ষণের পাশাপাশি pH, দ্রবীভূত অক্সিজেন, light dose ও trace metals নথিবদ্ধ করা উচিত।

pH, আলো ও ঘনত্ব ভিন্ন ভিন্ন দিকে প্রভাব ফেলে

নতুনরা প্রায়ই জিজ্ঞেস করেন, acid নাকি base বিক্রিয়াটি দ্রুত করে। নির্ভুল উত্তর হলো, pH চক্রের দুটি আলাদা অংশে কাজ করে। অম্লীয় জলীয় পরিবেশে প্রোটনের প্রাপ্যতা অ্যাসকরবেট থেকে MB+ বিজারণ ধাপকে দ্রুত করতে পারে। কিন্তু LMB নিজেই acid-এ বায়ু দ্বারা জারণের বিরুদ্ধে অনেক বেশি প্রতিরোধী, আর pH বাড়লে এটি অনেক দ্রুত পুনর্জারিত হয়। ফলে একটি অম্লীয় নমুনা দ্রুত বিবর্ণ হয়ে পরে স্বচ্ছ থাকতে পারে, অন্যদিকে একটি alkaline নমুনা বিবর্ণ হয়ে দ্রুত আবার নীল হতে পারে। নিজ নিজ শর্তে দুটি পর্যবেক্ষণই সঠিক।

আলো আলাদা একটি পথ যোগ করে। আলো দ্বারা উত্তেজিত মিথিলিন ব্লু একটি দীর্ঘস্থায়ী triplet state-এ পৌঁছে, যা অ্যাসকরবেট ও অক্সিজেনের সঙ্গে electron transfer করে। wavelength, অক্সিজেনের মাত্রা ও ঘনত্বের ওপর নির্ভর করে এই photochemistry বিবর্ণ হওয়া দ্রুত করতে, রং পুনরুদ্ধার করতে বা reactive oxygen species তৈরি করতে পারে। illumination-কে একটি পরীক্ষামূলক চলক হিসেবে বিবেচনা করুন এবং তা নথিবদ্ধ করুন।

ঘনত্ব নির্ধারণ করে কোন দিকটি প্রাধান্য পাবে। বেশি অ্যাসকরবেট মানে দ্রুত বিবর্ণ হওয়া এবং বেশি shake and fade cycle। বেশি রঞ্জকের জন্য আনুপাতিকভাবে বেশি reducing equivalents দরকার। বেশি দ্রবীভূত অক্সিজেন নীল অবস্থাকে উৎসাহিত করে। উচ্চ রঞ্জক ঘনত্বে আরও একটি জটিলতা দেখা দেয়, কারণ মিথিলিন ব্লু স্ব-সংযোজিত হয়ে dimer ও aggregate তৈরি করে যাদের spectrum পরিবর্তিত থাকে। ফলে রঞ্জকের পরিমাণ দ্বিগুণ করলে আর একই আচরণ দ্বিগুণ হয় না।

ভিটামিন C কি মিথিলিন ব্লুকে নিরপেক্ষ করে?

মিথিলিন ব্লু ও ভিটামিন C নিয়ে অধিকাংশ অনুসন্ধানের পেছনে এই প্রশ্নটিই থাকে, এবং এর নির্ভুল উত্তর প্রয়োজন। না, রং হারানো মানেই নিরপেক্ষীকরণ নয়। chromophore-এর অবস্থা বদলেছে, কিন্তু phenothiazine core এবং এর redox activity দ্রবণে রয়ে গেছে। বায়ুর মাধ্যমে বিক্রিয়াটি প্রত্যাবর্তনযোগ্য, এবং বিজারিত রূপটিও নিজে সক্রিয়: MB+-এর তুলনায় LMB আধানহীন ও lipophilic, এবং cell work-এ এটি membrane অতিক্রম করে ভেতরে পুনর্জারিত হয়।

কোষভিত্তিক গবেষণা বিষয়টি আরও স্পষ্ট করে। cultured endothelial cells-এ low micromolar মিথিলিন ব্লু NADPH ও NADH জারিত করার পাশাপাশি pentose phosphate activity উদ্দীপিত করে, এবং প্রায় 5 micromolar-এর ওপরে glucose support অনুপস্থিত থাকলে intracellular oxidant markers বাড়ায়। অ্যাসকরবেট-সমৃদ্ধ কোষ রঞ্জকের সংস্পর্শে এলে সেই অ্যাসকরবেট ধীরে ধীরে জারিত হয়, এবং অ্যাসকরবেটের উপস্থিতি oxidant signal-কে কেবল আংশিকভাবে দমন করে—যেমনটি রঞ্জকটির একটি endothelial redox গবেষণায় রিপোর্ট করা হয়েছে। অর্থাৎ, অ্যাসকরবেট রেডক্স আদান-প্রদানে অংশ নেয়। এটি রঞ্জকটিকে নিষ্ক্রিয় করে না।

আলো উপস্থিত থাকলে বিষয়টি আরও স্পষ্ট হয়। illumination-এর অধীনে মিথিলিন ব্লু, অ্যাসকরবেট ও অক্সিজেনের মিশ্রণ অক্সিজেন ব্যবহার করে, hydrogen peroxide জমা করে এবং catalytic iron-এর উপস্থিতিতে Fenton chemistry-এর মাধ্যমে hydroxyl radical তৈরি করে, যেমনটি spin trapping ও oxygen uptake পরীক্ষায় দেখানো হয়েছে। Hydroxyl radicals অপরিবর্তনীয়ভাবে biomolecules ক্ষতিগ্রস্ত করতে এবং রঞ্জকটিকেই অবক্ষয় করতে পারে। তাই আলো ও iron contamination-এর উপস্থিতিতে স্থায়ীভাবে বিবর্ণ হয়ে যাওয়া কোনো নমুনা পরিষ্কার বিজারণ দেখাচ্ছে না। সেখানে পার্শ্ব-রসায়নের মাধ্যমে ধ্বংসও ঘটতে পারে।

স্বচ্ছ দ্রবণ যা প্রমাণ করে না

তিনটি প্রচলিত সিদ্ধান্ত প্রমাণের সীমা অতিক্রম করে এবং lab notes, labels ও teaching slides-এ এগুলো এড়ানো উচিত।

প্রথমত, স্বচ্ছ মানেই ক্ষতিহীন নয়। LMB-এর সঙ্গে অক্সিজেন ও trace metals, বিশেষ করে আলোতে, peroxide ও radical pathway-কে চালিত করতে পারে। ক্ষতিহীনতা নির্ধারণে toxicology দরকার, colorimetry নয়।

দ্বিতীয়ত, স্বচ্ছ মানেই decontaminated নয়। রঞ্জক ও এর redox partners এখনও উপস্থিত থাকে। অ্যাসকরবেট যোগ করলেই spills, effluents ও stained materials পরিশোধিত হয়ে যায় না। Analytical confirmation প্রয়োজন; residue এবং decontamination testing practice-এ এই বিষয়টি অন্তর্ভুক্ত।

তৃতীয়ত, স্বচ্ছতা কোনো উপযোগী combined regimen নির্ধারণ করে না। test tube-এর বিক্রিয়া মানুষের absorption, tissue distribution, dosing বা interaction safety সম্পর্কে কিছু বলে না। স্বাস্থ্যগত উদ্দেশ্যে পদার্থ দুটিকে একত্রে ব্যবহারের কথা ভাবলে আগে interaction ও safety literature পড়া এবং একটি vial-এর ফল থেকে অনুমান না করে যোগ্য সূত্রের পরামর্শ নেওয়া উচিত।

সঠিক ব্যাখ্যাটি সীমিত, কিন্তু বেশি উপযোগী। মিথিলিন ব্লু ও অ্যাসকরবেট একসঙ্গে redox cycling-এর একটি সংক্ষিপ্ত মডেল: ভিটামিন C ইলেকট্রন দান করে, রঞ্জক বর্ণহীন হয়, অক্সিজেন ইলেকট্রন ফিরিয়ে নেয়, রং ফিরে আসে, আর আলো, pH, ঘনত্ব ও আয়রন গতি ও side products নির্ধারণ করে। ধারণাটি পরিষ্কার হয়ে গেলে প্রদর্শনটি আর কৌশল বলে মনে হয় না; এটি একটি diagnostic হয়ে ওঠে। আপনার নমুনা ভিন্নভাবে আচরণ করলে রঞ্জকটি নিয়ে প্রশ্ন তোলার আগে oxygen access, light dose, pH ও metal contamination পরীক্ষা করুন।