বেশি অক্সিজেন ব্যবহার কি বেশি ATP বোঝায়? মেথিলিন ব্লু গবেষণার শিক্ষা

একটি বিচ্ছিন্ন mitochondrion-কে জ্বালানি সহ কিন্তু ADP ছাড়া একটি চেম্বারে রাখা হয়েছে। এটি ধীরে অক্সিজেন ব্যবহার করে। ADP যোগ করুন এবং অক্সিজেন ব্যবহার কয়েক গুণ বেড়ে যায়। ADP শেষ হওয়ার জন্য অপেক্ষা করুন এবং অক্সিজেন ব্যবহার আবার কমে যায়। জ্বালানি কখনো পরিবর্তিত হয়নি। শুধু ATP-এর চাহিদা পরিবর্তিত হয়েছে।

এই ছোট ধারাবাহিকতায় এই নিবন্ধের মূল পার্থক্যটি রয়েছে। অক্সিজেন ব্যবহার পরিমাপ করে শ্বসন শৃঙ্খলের মাধ্যমে অক্সিজেনে ইলেকট্রন কত দ্রুত প্রবাহিত হয়। ATP উৎপাদন পরিমাপ করে সেই প্রবাহের কত অংশ ব্যবহারযোগ্য শক্তি হিসেবে ধারণ করা হয়। দুটি একটি মধ্যবর্তী ধাপ ভাগ করে, যা হলো অভ্যন্তরীণ mitochondrial membrane জুড়ে proton gradient, এবং gradient কতটা শক্তভাবে ATP synthesis-এর সঙ্গে যুক্ত তা পরিবর্তিত হলে দুটি শেষ ফলাফল ভিন্ন দিকে যেতে পারে। মেথিলিন ব্লু এখানে একটি কার্যকর উদাহরণ, কারণ এটি উভয় আচরণই দেখিয়েছে: কিছু প্রস্তুতিতে ATP-এর সঙ্গে অক্সিজেন ব্যবহার বাড়িয়েছে, আবার অন্য ক্ষেত্রে ATP অপরিবর্তিত বা কম থাকা অবস্থায় অক্সিজেন ব্যবহার বাড়িয়েছে।

যারা আগে বৃহত্তর relay চিত্রটি বুঝতে চান তারা পড়তে পারেন কীভাবে মেথিলিন ব্লু respiratory chain-এর মাধ্যমে ইলেকট্রন স্থানান্তর করে, এবং যারা প্রাথমিক অক্সিজেন পরীক্ষার পরিভাষা জানতে চান তারা পড়তে পারেন প্রথম respiration measurements আসলে কী দেখিয়েছিল।

শ্বসন, ATP, এবং তাদের মধ্যবর্তী gradient

NADH এবং FADH2 থেকে আসা ইলেকট্রন complex I এবং II দিয়ে শৃঙ্খলে প্রবেশ করে, complex III হয়ে cytochrome c-তে যায়, তারপর complex IV দিয়ে অক্সিজেনে পৌঁছায়। Complex I, III এবং IV-এ মুক্ত হওয়া শক্তি proton-কে matrix থেকে intermembrane space-এ পাম্প করে। এই চার্জ এবং অম্লতার বিভাজনই proton motive force, এবং এর বৈদ্যুতিক অংশ, membrane potential, সাধারণত প্রধান অংশ।

ATP synthase proton-কে আবার matrix-এ প্রবাহিত হতে দেয় এবং মুক্ত শক্তি ব্যবহার করে ADP ও phosphate যুক্ত করে ATP তৈরি করে। তাই শৃঙ্খলটি হলো:

অক্সিজেন ব্যবহার, তারপর proton pumping, তারপর gradient, তারপর ATP synthesis।

সমস্যা হলো proton অন্য পথেও ফিরে যেতে পারে। ATP synthase এড়িয়ে যে কোনো প্রত্যাবর্তন হলো proton leak। Leak-এর কারণে membrane potential স্থির রাখতে শৃঙ্খলকে একই proton আবার পাম্প করতে হয়, ফলে বেশি অক্সিজেন খরচ হয় কিন্তু বেশি ATP তৈরি হয় না। যথেষ্ট বেশি leak হলে তা uncoupling: অক্সিজেন ব্যবহার বাড়ে, ATP অপরিবর্তিত থাকে বা কমে, এবং অপচয় হওয়া শক্তি তাপ হিসেবে বেরিয়ে যায়।

State 3, state 4, এবং respiratory control ratio

এর প্রচলিত পরিভাষা এসেছে বিচ্ছিন্ন mitochondria থেকে। State 3 হলো substrate এবং ADP উপস্থিত থাকা অবস্থায় respiration: ATP synthase gradient ব্যবহার করে, membrane potential কমে, শৃঙ্খল তা পুনর্গঠন করতে দ্রুত কাজ করে, এবং ATP তৈরি হওয়ায় অক্সিজেন ব্যবহার বেশি হয়। State 4 হলো ADP শেষ হওয়ার পর respiration: ATP synthase নিষ্ক্রিয় থাকে, gradient বেড়ে যায়, উচ্চ membrane potential আরও pumping বাধাগ্রস্ত করে, এবং leak পূরণ করার জন্য যতটুকু প্রয়োজন ততটুকু অক্সিজেন ব্যবহার হয়।

Respiratory control ratio, অর্থাৎ state 3 ভাগ state 4, তাই প্রস্তুতিটি কতটা শক্তভাবে coupled তা দেখায়। উচ্চ ratio মানে ADP respiration-কে শক্তভাবে নিয়ন্ত্রণ করে। বাড়তে থাকা state 4-এর সঙ্গে ratio কমে যাওয়া মানে leak প্রভাবশালী হয়ে উঠছে। নিচের মেথিলিন ব্লু ফলাফল বোঝার জন্য এটাই দৃষ্টিভঙ্গি।

একটি মানসিক মডেল মনে রাখা দরকার। উচ্চ membrane potential শৃঙ্খলকে ধীর করে। Potential কমে গেলে তা দ্রুত হয়। শৃঙ্খল নির্ভর করে pumping কতটা কঠিন হয়েছে তার ওপর, সরাসরি ATP তৈরি হচ্ছে কি না তার ওপর নয়।

যখন শেষ ফলাফলগুলো একসঙ্গে পরিবর্তিত হয়

সবচেয়ে পরিষ্কার coupled উদাহরণ পাওয়া যায় বাধাপ্রাপ্ত respiratory complexes সহ বিচ্ছিন্ন guinea pig brain mitochondria-তে। 100 nanomolar থেকে 1 micromolar মেথিলিন ব্লু-তে glutamate plus malate, succinate, অথবা glycerophosphate জ্বালানি হিসেবে ব্যবহার করলে resting oxygen consumption বেড়েছিল, কিন্তু ADP-উদ্দীপিত respiration অপরিবর্তিত ছিল। Complex I বা complex III-তে বিষক্রিয়াগ্রস্ত mitochondria-তে dye সামান্য ATP production বাড়িয়েছিল, membrane potential পুনরুদ্ধার করেছিল এবং calcium uptake উন্নত করেছিল। প্রস্তাবিত পথটি একটি shortcut: dye বাধার উপরের অংশ থেকে ইলেকট্রন গ্রহণ করে এবং cytochrome c-তে পৌঁছে দেয়, ক্ষতিগ্রস্ত complex-কে এড়িয়ে যায়।

দ্বিতীয় coupled ক্ষেত্রে সম্পূর্ণ ভিন্ন ATP উৎস ব্যবহৃত হয়েছে। ATP synthase বাধাগ্রস্ত অবস্থায় বিচ্ছিন্ন brain mitochondria-তে মেথিলিন ব্লু পরীক্ষিত প্রতিটি substrate-এ respiration উদ্দীপিত করেছিল। কিন্তু ATP synthesis বেড়েছিল শুধু alpha ketoglutarate এবং glutamate-এ, যে দুটি substrate succinyl CoA তৈরি করে। Oligomycin ATP synthase বন্ধ করে দিলে অতিরিক্ত ATP oxidative phosphorylation থেকে নয়, citric acid cycle-এর succinyl CoA ligase-এর substrate level phosphorylation থেকে এসেছিল। Complex I এবং ATP synthase একসঙ্গে বাধাগ্রস্ত হলে dye membrane potential-ও পুনরুদ্ধার করেছিল। এখানে অক্সিজেন ব্যবহার এবং ATP একসঙ্গে বেড়েছিল, কিন্তু শুধু যেখানে substrate দ্বিতীয় ATP pathway-কে অনুমতি দিয়েছে। Succinate বা malate-এ respiration বেড়েছিল কিন্তু অতিরিক্ত ATP হয়নি। একই dye, একই chamber, ভিন্ন fuel, ভিন্ন উত্তর।

যখন শেষ ফলাফলগুলো আলাদা হয়ে যায়

বিচ্ছিন্নতার ঘটনাগুলোও সমানভাবে প্রকাশিত এবং শিক্ষণীয়। 1997 সালের একটি বিচ্ছিন্ন rat liver mitochondria গবেষণায়, মেথিলিন ব্লু tightly coupled succinate respiring mitochondria-তে state 4 respiration দ্রুত করেছিল, যার ফলে respiratory control ratio কমে যায়। প্রভাবটি 0.5 micromolar থেকে দেখা যায় এবং 5 micromolar-এ শক্তিশালী ছিল, যা 100 milligram intravenous bolus-এর পর plasma levels-এর কাছাকাছি concentration। 5 micromolar-এ mitochondria ফুলেও গিয়েছিল, যদিও coupling defect কম concentration-এ আগে দেখা যায়, যা নির্দেশ করে leak structural damage-এর আগে এসেছিল, তার কারণে নয়। Uncoupled mitochondria-তে dye একটি saturable, concentration dependent উপায়ে respiration উদ্দীপিত করেছিল। উভয় প্রস্তুতিতেই অক্সিজেন ব্যবহার বেড়েছিল। প্রতি oxygen consumed-এ ATP synthesis বাড়েনি। এটি একই molecule-এ textbook uncoupling এবং electron shuttling-এর উদাহরণ।

সবচেয়ে উল্লেখযোগ্য বিভাজন দেখা যায় retina-তে। AIF deficient mice এবং rotenone treated photoreceptor cells-এ, মেথিলিন ব্লু retinal thickness, photoreceptor markers এবং mitochondrial structure সংরক্ষণ করেছিল, এবং NADH থেকে NAD ratio কমিয়েছিল ও unfolded protein response এবং mitophagy সহ stress pathways কমিয়েছিল। এটি ATP ঘাটতি সংশোধন না করেই ঘটেছিল। ATP পুনরুদ্ধার ছাড়া সুরক্ষা মানে উপকারটি অতিরিক্ত ATP থেকে নয়, বরং redox balance এবং mitochondrial integrity-এর মাধ্যমে এসেছে। টিস্যুর টিকে থাকাকে শক্তি উৎপাদন পুনরুদ্ধারের সমান ধরে নিলে সেই পরীক্ষার অর্থ ভুল বোঝা হবে।

Brain mitochondria গবেষণা একই হিসাবের একটি cost column যোগ করে। একই কম concentration যা bioenergetics উন্নত করেছিল তা পরীক্ষিত প্রতিটি অবস্থায় hydrogen peroxide উৎপাদনও বাড়িয়েছিল এবং তার অপসারণ ধীর করেছিল, যা nonspecific dye নয় বরং calibrated Amplex assay দিয়ে মাপা হয়েছিল। বেশি ATP এবং বেশি oxidant একসঙ্গে এসেছিল।

ব্যবহারিক পড়ার checklist

চারটি প্রশ্ন coupled ফলাফল এবং uncoupled ফলাফল আলাদা করে।

প্রথমত, কোন endpoint আসলে মাপা হয়েছে। শুধু oxygen consumption ATP জানাতে পারে না। ATP synthesis, membrane potential এবং respiratory control ratio প্রত্যেকটি এমন একটি অংশ যোগ করে যা oxygen electrode দেখতে পারে না। মেথিলিন ব্লু গবেষণার দাবি পড়ার নির্দেশিকা এই endpoint discipline বিস্তারিতভাবে ব্যাখ্যা করে।

দ্বিতীয়ত, mitochondria-কে কোন substrate খাওয়ানো হয়েছে। Succinyl CoA ফলাফল দেখায় যে fuel নির্বাচন ঠিক করতে পারে অতিরিক্ত respiration আদৌ অতিরিক্ত ATP-তে রূপান্তরিত হবে কি না।

তৃতীয়ত, কোন concentration ব্যবহার করা হয়েছে। Brain mitochondria-তে nanomolar থেকে low micromolar মেথিলিন ব্লু oxidant cost সহ সামান্য bioenergetic লাভ দিয়েছে; liver mitochondria-তে half micromolar এবং তার বেশি concentration coupling দুর্বল করেছে; 5 micromolar swelling যোগ করেছে। Concentration প্রক্রিয়ার অংশ, শুধু পটভূমির তথ্য নয়।

চতুর্থত, কোন model-এ ফলাফল পাওয়া গেছে। বিচ্ছিন্ন mitochondria কার্যপ্রণালী প্রকাশ করে, কিন্তু intact cells এবং tissues transport, colourless form-এ reduction, এবং ইলেকট্রনের জন্য প্রতিযোগী sink যোগ করে। Laboratory dosing work, যেখানে concentration এবং protocol কীভাবে মেথিলিন ব্লু-এর প্রভাব গঠন করে তা দেখা হয়, chamber-এর সংখ্যাকে কোনো ব্যক্তির ক্ষেত্রে প্রযোজ্য দাবির সঙ্গে যুক্ত করার সেতু।

অক্সিজেন ব্যবহার ইলেকট্রন প্রবাহ রিপোর্ট করে। ATP রিপোর্ট করে সেই প্রবাহের কত অংশ ধারণ করা হয়েছে। মেথিলিন ব্লু যেকোনো একটিকে পরিবর্তন করতে পারে, এবং উপরের পরীক্ষাগুলো চারটি সম্ভাব্য সমন্বয় দেখায়: উভয়ই বাড়ে, substrate অনুমতি দিলে শুধু respiration বাড়ে, coupling কমার সময় respiration বাড়ে, এবং ATP অপরিবর্তিত থাকলেও tissue সংরক্ষিত হয়। Oxygen electrode-এর সংখ্যা ব্যাখ্যার শুরু, শেষ নয়।