EMB agar বনাম MacConkey agar: মিডিয়া নির্বাচন ও ব্যাখ্যা

একজন শিক্ষার্থী একই পানির নমুনা দুটি প্লেটে স্ট্রিক করে। একটিতে সবুজ ধাতব চকচকে গাঢ় কলোনি দেখা যায়। অন্যটিতে ঝাপসা হ্যালোসহ উজ্জ্বল গোলাপি কলোনি দেখা যায়। দুটি প্লেটেই একই টিউব থেকে ইনোকুলেশন করা হয়েছে, পাশাপাশি ইনকিউবেট করা হয়েছে এবং একই সময়ে পড়া হয়েছে। শিক্ষার্থী জানতে চায় কোন প্লেটটি সঠিক।

দুটি প্লেটই সঠিক। তারা ভিন্ন প্রশ্নের উত্তর দেয়। বিভ্রান্তি তৈরি হয় যখন এই দুটি মিডিয়াকে অন্ত্রের ব্যাকটেরিয়া শনাক্তের বিনিময়যোগ্য স্ক্রিন হিসেবে ধরা হয়। উভয়ের উদ্দেশ্য এক—গ্রাম-নেগেটিভ এন্টারিক অর্গানিজম নির্বাচন করা এবং ল্যাকটোজ ফারমেন্টারকে ননফারমেন্টার থেকে আলাদা করা—কিন্তু তারা ভিন্ন রসায়ন ও ভিন্ন দৃশ্যমান যুক্তির মাধ্যমে সেই উদ্দেশ্য বাস্তবায়ন করে। এই দুটি মৌলিক ধারণা বুঝে গেলে প্লেট নির্বাচন ও কলোনি পড়া নিয়মিত কাজ হয়ে যায়।

সংক্ষিপ্ত উত্তর

EMB agar দুটি ডাই—eosin Y এবং methylene blue—ব্যবহার করে, যেগুলো একই সঙ্গে দুটি কাজ করে: এগুলো গ্রাম-পজিটিভ বৃদ্ধি দমন করে এবং শক্তিশালী অ্যাসিড উৎপাদকদের চারপাশে প্রিসিপিটেট হয়ে গাঢ় কলোনি তৈরি করে; Escherichia coli-এর ক্ষেত্রে ধ্রুপদি বৈশিষ্ট্য হলো ধাতব সবুজ শিন। MacConkey agar কাজগুলো আলাদা করে: bile salts ও crystal violet গ্রাম-পজিটিভকে দমন করে, lactose ফারমেন্টেশনের সাবস্ট্রেট সরবরাহ করে এবং neutral red অ্যাসিড উৎপাদনকে গোলাপি বা লাল কলোনি হিসেবে দেখায়। কাজটি যদি E. coli-এর একটি স্পষ্ট presumptive প্রদর্শন হয়, EMB উপযোগী। আর যদি কাজটি হয় ল্যাকটোজ ফারমেন্টারকে ননফারমেন্টার থেকে পরিষ্কারভাবে গোলাপি বনাম বর্ণহীন হিসেবে আলাদা করা, বিশেষ করে stool বা urine workflow-এ, তাহলে MacConkey সাধারণত পড়তে সহজ। শুধু রঙ দেখে কোনো প্লেটই কোনো অর্গানিজমকে শনাক্ত করে না।

EMB: একই সঙ্গে নির্বাচন ও সংকেত দেওয়া ডাই

EMB-এর ধারণায় একই অণু নির্বাচন ও নির্দেশনার কাজ করে। ASM eosin methylene blue agar protocol EMB-কে একই সঙ্গে selective ও differential হিসেবে বর্ণনা করে; এতে ডাই-জোড়া বহু গ্রাম-পজিটিভ অর্গানিজমকে দমন করে, আর lactose fermentation ডাই গ্রহণ ও precipitation ঘটায়। একটি মানক Levine formulation-এ peptone, lactose, phosphate, eosin Y, methylene blue এবং agar থাকে, যেমন FDA BAM method for Levine EMB agar-এ তালিকাভুক্ত আছে। লক্ষ করুন, পুরোনো কিছু EMB recipe-তে lactose-এর সঙ্গে sucrose-ও যোগ করা হতো, কিন্তু Levine EMB-তে lactose থাকে, sucrose থাকে না। তাই আপনার ল্যাবরেটরিতে কোন formulation মজুত আছে তা নথিভুক্ত করুন।

EMB পড়ার অর্থ হলো ডাইয়ের আচরণ পড়া। প্রবল lactose fermentation যথেষ্ট অ্যাসিড তৈরি করে, ফলে ব্যাপক dye precipitation হয়; এতে E. coli-এর কেন্দ্র গাঢ় নীল-কালো হয় এবং ধ্রুপদি ক্ষেত্রে প্রতিফলিত আলোতে সবুজ ধাতব শিন দেখা যায়। Enterobacter ও Klebsiella-এর মতো অপেক্ষাকৃত দুর্বল ফারমেন্টার সাধারণত গোলাপি থেকে বেগুনি, mucoid কলোনি হিসেবে বৃদ্ধি পায় এবং সেই শিন থাকে না। Salmonella, Shigella ও Proteus-এর মতো ননফারমেন্টার সাধারণত বর্ণহীন বা স্বচ্ছ কলোনি তৈরি করে, কারণ তারা ডাই precipitate করার মতো হঠাৎ অ্যাসিড উৎপাদন করে না। গ্রাম-পজিটিভ সাধারণত দমন হয়, যদিও দমনের মাত্রা strain ও product অনুযায়ী ভিন্ন হয়। methylene blue প্রথম থেকেই কেন একটি cationic stain হিসেবে আচরণ করে তা-সহ সম্পূর্ণ dye preparation chemistry ডাই formulation নিয়ে পৃথক আলোচনার বিষয়, আর সাধারণ microscopy প্রসঙ্গ রয়েছে স্টেইনিং পদ্ধতির একটি অ্যাটলাসে। এই নিবন্ধটি প্লেট নির্বাচন ও ফলাফল পড়াতেই সীমাবদ্ধ।

উপরের চিত্রটি উদাহরণমূলক। এটি প্রত্যাশিত দৃশ্যমান যুক্তি দেখায়: EMB-তে গাঢ় শিনযুক্ত কলোনি, গোলাপি mucoid ধরনের কলোনি ও ফ্যাকাশে ধরনের কলোনি; এর বিপরীতে MacConkey-তে গোলাপি বনাম ফ্যাকাশে ধরনের কলোনি। প্যাটার্ন শেখার জন্য এটি ব্যবহার করুন, তারপর প্রতিটি সিদ্ধান্ত photographed control এবং আপনার বেঞ্চে থাকা নির্দিষ্ট medium-এর product insert-এর সঙ্গে যাচাই করুন।

MacConkey: আলাদা কাজ, সহজ দৃশ্যমান নিয়ম

MacConkey-এর ধারণায় প্রতিটি কাজ আলাদা উপাদানকে দেওয়া হয়। ASM MacConkey agar protocol একই selective ও differential কাঠামো উপস্থাপন করে, আর FDA BAM method for MacConkey agar-এ কার্যকর উপাদানগুলো তালিকাভুক্ত রয়েছে: peptones, lactose, bile salts, salt, neutral red, crystal violet এবং agar। Bile salts ও crystal violet একসঙ্গে গ্রাম-পজিটিভের বিরুদ্ধে নির্বাচন করে। Lactose fermentation substrate সরবরাহ করে। Neutral red pH reporter হিসেবে কাজ করে; যেখানে অ্যাসিড তৈরি হয় সেখানে এটি গোলাপি থেকে লাল হয়ে যায়, এবং শক্তিশালী ফারমেন্টারের চারপাশে কখনও precipitated bile-ও দেখা যায়।

পড়ার নিয়মটি ইচ্ছাকৃতভাবে সহজ: গোলাপি মানে lactose fermenter, বর্ণহীন বা ফ্যাকাশে মানে nonfermenter। E. coli গোলাপি থেকে লাল দেখায় এবং প্রায়ই bile precipitate halo থাকে। Klebsiella ও Enterobacter গোলাপি হয় এবং তাদের capsule-এর কারণে প্রায়ই mucoid দেখায়। Salmonella, Shigella, Proteus এবং আরও অনেক গ্রাম-নেগেটিভ rod বর্ণহীন দেখায়। Teaching lab-এ একটি অতিরিক্ত সুবিধাও গুরুত্বপূর্ণ: bile salts সাধারণত Proteus swarming কমায়, তাই nonselective media-এর তুলনায় MacConkey-তে isolated colony পাওয়া সহজ; তবে এই দমন সম্পূর্ণ নয় এবং swarming নিয়ন্ত্রণই অগ্রাধিকার হলে salt free বিকল্পও রয়েছে।

ডাইগুলো কেন এভাবে আচরণ করে তার molecular কারণ charge ও structure-এর সঙ্গে সম্পর্কিত। Methylene blue একটি cationic phenothiazine dye, যার গঠন ও বৈশিষ্ট্য acidic bacterial surface-এর প্রতি এর affinity ব্যাখ্যা করে; EMB-তে acid zone-এ precipitate হওয়ার সময়ও একই affinity কাজ করে।

এক নজরে তুলনা

টেবিলটিকে একটি সিদ্ধান্ত-পদ্ধতি হিসেবে পড়ুন। যখন অনুশীলনে শিক্ষার্থীদের fermentation strength-এর একটি gradient এবং একটি নাটকীয় endpoint দেখাতে হয়, EMB তা দেখায়। যখন biochemical confirmation-এর আগে দ্রুত binary sort দরকার হয়, MacConkey তা দেখায়।

কোন নমুনার জন্য কোন মিডিয়া

Presumptive fecal coliform বা E. coli শনাক্তকরণ শেখানোর উদ্দেশ্যে water exercise-এ EMB আকর্ষণীয়, কারণ শিনটি দৃশ্যত স্বতন্ত্র। MacConkey-ও enteric গ্রাম-নেগেটিভ পরিচালনা করতে পারে এবং ঐতিহাসিকভাবে water testing-এ ব্যবহৃত হয়েছে, কিন্তু কোনো প্লেটই regulatory water method-এর বিকল্প নয়; পরীক্ষাভেদে modified mTEC বা MI-এর মতো media নির্ধারিত থাকতে পারে। আপনার ল্যাবরেটরিকে যে method অনুসরণ করতে হয় সেটি যাচাই করুন।

Stool style separation-এ fermenter ও nonfermenter আলাদা করার জন্য এই দুটির মধ্যে MacConkey সাধারণত বেশি উপযোগী। Salmonella বা Shigella-এর ব্যবহারিক stool work-এ সাধারণত শুধু MacConkey-এর ওপর নির্ভর না করে XLD বা Hektoen enteric-এর মতো আরও selective enteric media যোগ করা হয়।

Clinical workflow অনুকরণকারী urine style teaching-এ MacConkey-এর সঙ্গে blood agar ব্যবহার করুন। MacConkey প্রাথমিক গ্রাম-নেগেটিভ sort দেয়, আর blood agar সেই অর্গানিজমও পুনরুদ্ধার করে যেগুলো MacConkey দমন করে। Urine culture setup-এর clinical description-এ এই pairing মানক।

শুধু ধারণা শেখানোর জন্য দুটিই চালান। EMB শেখায় যে fermentation strength গুরুত্বপূর্ণ এবং একটি molecule দুটি ভূমিকা পালন করতে পারে। MacConkey modular design শেখায়: selector, substrate এবং reporter আলাদা রাখা হয়। যারা পরিচিত E. coli, পরিচিত Klebsiella aerogenes এবং পরিচিত Salmonella দুটো media-তেই পাশাপাশি streak করে, তারা সাধারণত এই দুই যুক্তি আর গুলিয়ে ফেলে না।

প্রতি টার্মে পুনরাবৃত্ত ফলাফল-পড়ার ভুল

সবচেয়ে সাধারণ ভুল হলো শুধু রঙ দেখে identification করা। MacConkey-তে গোলাপি colony E. coli, Klebsiella, Enterobacter বা অন্য কোনো fermenter হতে পারে। বর্ণহীন colony Salmonella, Shigella, Proteus, Pseudomonas বা অন্য কোনো nonfermenter হতে পারে। রঙ একটি screening phenotype, যা Gram stain, oxidase, biochemical panel বা instrument identification-এর মতো confirmatory work-এর দিক নির্দেশ করে; এটি কোনো species name নয়।

দ্বিতীয় ভুল হলো শিন না থাকাকে অতিরিক্ত গুরুত্ব দেওয়া। কিছু প্রকৃত E. coli colony, বিশেষ করে isolated colony, EMB-তে অল্প বা কোনো metallic sheen তৈরি করে না। শিন না থাকা E. coli-কে বাদ দেয় না, আর শিন থাকা এটিকে প্রমাণও করে না। শিনকে presumptive clue হিসেবে বিবেচনা করুন।

তৃতীয় ভুল হলো ভিন্ন বয়সের প্লেট তুলনা করা। দীর্ঘ incubation-এর পর delayed lactose fermenter MacConkey-তে গোলাপি হয়ে যেতে পারে, ফলে fermenter বনাম nonfermenter-এর পরিষ্কার বিভাজন ঝাপসা হয়। ল্যাবরেটরি নির্ধারিত সময়ে পড়ুন এবং ফলাফলের সঙ্গে incubation time নথিভুক্ত করুন।

চতুর্থ ভুল হলো mixed growth-কে একটি organism হিসেবে পড়া। বর্ণহীন colony-এর পাশে একটি গোলাপি colony দুটি phenotype নির্দেশ করে, কোনো intermediate নয়। ভালোভাবে isolated colony বেছে নিন এবং প্রতিটি morphotype আলাদাভাবে কাজ করুন। Mucoid texture-ও একই ধরনের ফাঁদ তৈরি করে: Klebsiella ও Enterobacter দুটিই mucoid দেখাতে পারে, তাই শুধু capsule কখনও নাম নির্ধারণ করে না। যে organism-টিকে একসময় Enterobacter aerogenes হিসেবে শেখানো হতো, সেটি এখন Klebsiella aerogenes হিসেবে শ্রেণিবদ্ধ; তাই পুরোনো chart এবং নতুন label পরস্পরবিরোধী বলে মনে হতে পারে।

কন্ট্রোল এবং শেষ নিয়ম

প্রতি session-এ photographed বা fresh control চালান: strong fermenter reaction-এর জন্য E. coli, classic sheen ছাড়া mucoid fermentation-এর জন্য Klebsiella aerogenes, colorless nonfermenter reaction-এর জন্য একটি Salmonella strain এবং আপনার নির্দিষ্ট product-এ গ্রাম-পজিটিভ suppression নিশ্চিত করতে Staphylococcus aureus। Strain number ও acceptance criteria manufacturer insert-এর সঙ্গে মিলিয়ে নিন, কারণ bile, crystal violet এবং dye content-এর পরিবর্তনে selectivity বদলে যায়।

বেঞ্চে একটি বাক্য মনে রাখুন। EMB এমন ডাই ব্যবহার করে যা একই সঙ্গে নির্বাচন করে ও সংকেত দেয়; এর ফলে সূক্ষ্মতর read-এর বিনিময়ে একটি নাটকীয় E. coli signal পাওয়া যায়। MacConkey নির্বাচন ও সংকেত দেওয়ার কাজ আলাদা করে; এর ফলে fermentation-এর কম বিস্তারিতের বিনিময়ে সহজ গোলাপি বনাম ফ্যাকাশে sort পাওয়া যায়। যে প্রশ্নের সঙ্গে medium-এর ধারণা মেলে সেটি বেছে নিন, উপযুক্ত পরীক্ষায় রঙ যাচাই করুন, তাহলেই দুটি প্লেট প্রতিযোগী না হয়ে পরস্পরের পরিপূরক হয়ে ওঠে।