Защо метиленовото синьо се използва като контраоцветител при киселинноустойчиво оцветяване

Лаборант изследва натривка от храчка след цялата последователност на оцветяване. Червени пръчици изпъкват на синьо поле и резултатът се отчита като наличие на киселинноустойчиви бацили. На следващия ден друг препарат показва еднородно синьо поле без червени пръчици и се отчита като отрицателен за туберкулоза. Един от тези резултати твърди повече, отколкото препаратът позволява да се заключи, и това не е първият.

Объркването е концептуално. Лаборантът е възприел синьото багрило като част от химичния механизъм на откриване, сякаш метиленовото синьо помага да се намерят микобактериите. То не прави това. Когато метиленовото синьо достигне препарата, изпитването вече е приключило. Багрилото само оцветява фона, за да може резултатът да се разчете. Тази статия обяснява ролята на метиленовото синьо при киселинноустойчиво оцветяване, защо се използва синьо, а не друг цвят, и какви заключения позволява червеното на син фон.

Краткият отговор

Киселинноустойчивото оцветяване е диференциално изпитване, основано на три принципа. Карболфуксинът, основното багрило, се въвежда принудително във всяка клетка, включително в микобактериите с восъкоподобна обвивка. Киселинният алкохол, обезцветителят, извлича червеното багрило от обикновените клетки, но не успява да го извлече от киселинноустойчивите. След това метиленовото синьо, контраоцветителят, оцветява всичко, от което обезцветителят е отстранил багрилото. Така некиселинноустойчивите клетки, клетките на гостоприемника и клетъчните остатъци изглеждат сини, а киселинноустойчивите бацили остават червени. Контраоцветителят осигурява контраст. Той не участва в химичния механизъм, който прави една клетка киселинноустойчива.

Какво прави всяка стъпка

Схемата по-долу показва разпределението на ролите. Четете я отляво надясно като последователност на процедурата, а долната лента — като напомняне, че всяка група методи за оцветяване отговаря на различен въпрос.

Проникването е първо. Микобактериите са устойчиви на обикновени водни багрила, защото обвивката им е необичайно хидрофобна, затова протоколът принудително осигурява проникването. При метода на Цил–Нилсен нагряването до отделяне на пара вкарва съдържащия фенол карболфуксин през восъкоподобната стена. При студения метод на Киньон нагряването се заменя с много по-концентриран състав на основното багрило, а някои модифицирани варианти без нагряване добавят повърхностноактивни вещества. Протоколите за киселинноустойчиво оцветяване на Американското дружество по микробиология представят двата състава един до друг и разликата в концентрацията е значителна: приблизително 0.3 g основен фуксин на 100 mL при метода с нагряване срещу около 4 g при студения метод.

Диференцирането е второ. Киселинният алкохол, обикновено 3 mL концентрирана солна киселина в 97 mL етанол с концентрация 95 процента, отмива червеното багрило от всяка клетка, чиято стена не осигурява специална устойчивост. Клетките с неповредена микобактериална липидна обвивка задържат багрилото. Това е стъпката, от която зависи целият метод, и най-чувствителната към техниката на изпълнение, както е обсъдено по-долу.

Контрастът е последен. Сега препаратът съдържа червени киселинноустойчиви клетки върху почти безцветен фон от клетки, от които багрилото е извлечено. Метиленовото синьо с концентрация 0.3 процента w/v възстановява видимостта на този фон в цвят, максимално различен от червеното. Контраоцветяването е кратко, обикновено 20 до 30 секунди при метода с нагряване и до няколко минути при някои варианти на студения метод. Времето зависи от протокола, а не е свойство на самото багрило.

Защо това багрило и защо синьо

Метиленовото синьо е катионно основно багрило, което означава, че оцветеният му йон носи положителен заряд и се свързва с отрицателно заредените повърхности на обезцветените бактерии, клетките на гостоприемника и клетъчните остатъци. Учебникът по микробиология на OpenStax описва тази зависимост от заряда като общия принцип на основните багрила. Но в този случай метиленовото синьо не е химически уникално. Кристалвиолетът и сафранинът също са основни багрила. Изборът е оптичен, а не химичен.

Червените пръчици се нуждаят от фон в контрастен цвят, а синьото контрастира с червеното по най-полезния за светлополната микроскопия начин. Сафранинът би бил неподходящ контраоцветител, защото крайният му розово-червен цвят е твърде близък до този на задържания карболфуксин и заличава тъкмо разграничението, което процедурата е създала. Кристалвиолетът би дал тъмновиолетов фон, който се конкурира с тънките червени бацили за вниманието. Най-силното доказателство, че ролята е да се създава контраст, а не да се участва в химичния механизъм, е възможността за замяна: зелени контраоцветители като малахитово зелено и брилянтно зелено се използват в някои ветеринарни и модифицирани протоколи и изпитването продължава да работи, защото всеки ясно различим цвят изпълнява същата роля.

От това следват два практически извода. Първо, стандартната рецептура не предвижда корекция на pH; не бъркайте този обикновен воден разтвор с концентрация 0.3 процента с алкални състави като метиленовото синьо на Льофлер, които принадлежат към друга концепция за оцветяване. Второ, прекомерното оцветяване вреди. Хистологичната литература изрично предупреждава, че твърде плътният син фон може да прикрие малобройни бацили. Затова оставянето на багрилото върху препарата по-дълго, отколкото протоколът позволява, намалява разчитимостта без никаква полза.

Химичният състав на стената, който прави изпитването възможно

Причината киселинният алкохол да разграничава клетките се крие в микобактериалната обвивка. Нейното структурно ядро е миколил-арабиногалактан-пептидогликановият комплекс: пептидогликан, свързан с арабиногалактан, чиито външни краища носят миколови киселини с много дълги вериги. Те образуват богата на липиди външна микомембрана с необичайно ниска пропускливост. Обзорът на външната мембрана на микобактериите описва подробно тази архитектура. Бариерата действа и в двете посоки. Тя възпрепятства навлизането на багрилото, поради което проникването изисква нагряване или по-концентрирано основно багрило, и възпрепятства извличането му, поради което киселинният алкохол не успява да отстрани карболфуксина, след като той вече е вътре. Обикновените бактерии нямат тази обвивка и губят багрилото. Следователно киселинната устойчивост се разбира най-добре като явление, дължащо се на липидна бариера, а не като химично свързване на фуксина с миколовата киселина.

Този химичен механизъм обяснява и често срещана загадка: микобактериите се оцветяват слабо и непредсказуемо по метода на Грам, като понякога изглеждат като бледи, зърнисто оцветени форми или неоцветени призрачни очертания. Хидрофобната им стена ограничава проникването на кристалвиолета. Киселинноустойчивото оцветяване не е модифицирано оцветяване по Грам. То използва различен принцип на диференциране, основан на друго свойство на стената, както показва сравнението между простото оцветяване и оцветяването по Грам за другите два метода.

Три метода, три въпроса

За по-широката група методи за оцветяване на бактерии с едно багрило вижте атласа на оцветяването за микроскопия.

Какво не може да докаже червеното на син фон

Червените пръчици означават, че микроорганизмите са задържали карболфуксина при въздействието с киселинен алкохол. Тази находка е съвместима с Mycobacterium tuberculosis, но насоките на CDC за диагностика на туберкулоза изрично посочват, че и други микобактерии са киселинноустойчиви. Затова идентифицирането на вида изисква културелно изследване и изследване на нуклеинови киселини, а не цвят.

Грешките в техниката са съсредоточени около двете промивания. Недостатъчното обезцветяване оставя фоновия материал червен и създава предпоставки за фалшиво положително разчитане. Прекомерното обезцветяване извлича слабо задържаното основно багрило и допринася за фалшиво отрицателни резултати. Твърде интензивното контраоцветяване скрива малобройните бацили в синьото. Дебелите натривки, утаените реактиви и замърсената вода за промиване добавят свои артефакти.

Чувствителността е ограничена от количеството микроорганизми, независимо колко безупречно е изпълнена техниката. Конвенционалната микроскопия на натривка изисква приблизително 5,000 до 10,000 бацила на милилитър храчка, а по-стари обзори на доказателствата от CDC определят чувствителността на натривката на около 45 до 80 процента сред случаите на белодробна туберкулоза, потвърдени с културелно изследване. Следователно отрицателната натривка никога не изключва туберкулоза. Актуалните насоки на CDC предвиждат културелно изследване наред с всяка натривка и препоръчват изследване с амплификация на нуклеинови киселини на поне една респираторна проба, когато се обсъжда белодробна туберкулоза и резултатът би променил поведението.

Практическата работа изисква утвърдени протоколи

Учебните описания, включително тази статия, не дават разрешение за клинична работа. За практическа работа в лабораторията следвайте валидираната стандартна оперативна процедура на лабораторията, съобразена с актуалните документи на CDC, APHL или CLSI; справочният документ на CDC за киселинноустойчиво оцветяване, съхраняван в архива Stacks, показва как такива процедури определят реактивите и отчитането на резултатите. Работата с проби за туберкулоза изисква биологично обезопасяване: натривките се приготвят в бокс за биологична безопасност, защото при приготвянето се образуват аерозоли и пръски. Насоките на CDC за лабораторна безопасност посочват, че дори натривките, фиксирани чрез нагряване, могат да съдържат жизнеспособни туберкулозни бацили и трябва да продължат да се обработват като контаминирани. Записът в библиотеката на CDC за изображения в областта на общественото здраве за натривка, оцветена с карболфуксин и метиленово синьо и изследвана за M. leprae, е полезно напомняне за приложението на метода отвъд туберкулозата: същият контраст на червено върху синьо служи навсякъде, където се търсят киселинноустойчиви микроорганизми, а внимателно отчетената отрицателна находка сама по себе си е резултат, който си струва да бъде записан.

Разчитане на готовия препарат

Контраоцветителят показва полезността си при първоначалния оглед. Микроскопистът, който оглежда при малко увеличение, първо използва синия фон, за да прецени качеството на натривката: равномерно разпределение на клетките, запазени клетки на гостоприемника за фокусиране, липса на обилна утайка. След това предполагаемите червени бацили привличат погледа именно защото нищо друго в препарата не е червено. Потвърждаването става при маслена имерсия, при която истинските бацили показват очакваните тънки, понякога леко извити или зърнисто оцветени пръчици, а не еднородни частици от багрило.

Оцветяването на фона определя и формулировките в отчета. Препарат с червени бацили се отчита като „наблюдават се киселинноустойчиви бацили“, често с полуколичествена оценка по скалата на лабораторията. Препарат без червени микроорганизми се отчита като „не се наблюдават киселинноустойчиви бацили“, никога като „отрицателен за туберкулоза“. Разликата е важна, защото синьото поле доказва, че оцветяването е сработило, клетките са поели контраоцветителя и оптичните условия са били подходящи, но не казва нищо за микроорганизми под границата на откриване. Синьо поле без видими бацили е валиден резултат за препарата, а не заключение за пациента.

Помнете разпределението на ролите и формулирането на резултатите става лесно. Карболфуксинът открива предполагаемите бацили. Киселинният алкохол извършва изпитването. Метиленовото синьо само прави отговора четим: червеното е задържало багрилото въпреки киселината, синьото го е загубило. Всичко останало — видът, количеството микроорганизми и клиничното значение — се установява чрез работа извън препарата.