Просто оцветяване с метиленово синьо срещу оцветяване по Грам: какво може да докаже всеки метод

Студент подготвя натривка от култура, обозначена като E. coli, залива я с метиленово синьо за една минута, изплаква я и я разглежда през имерсионния обектив. Сини пръчици изпълват зрителното поле. В лабораторния протокол пише: „Грам-отрицателни пръчици, идентифицирани като E. coli.“ Наблюдението е правилно. Но този препарат не обосновава заключението.

Грешката е концептуална, а не техническа. Студентът е приел простото оцветяване за диференциален тест. Простото оцветяване и оцветяването по Грам отговарят на различни въпроси, защото се основават на различни принципи. Едното пита: каква форма се наблюдава. Другото пита: как се държи клетъчната стена при определено въздействие. Ако ги объркате, правилно оцветен препарат ще доведе до необоснован протокол.

Това сравнение разграничава двата метода, показва какви твърдения позволява всеки резултат и отговаря на двата най-чести студентски въпроса: може ли метиленово синьо да се използва при оцветяване по Грам и какво всъщност показва оцветяването на E. coli с метиленово синьо.

Краткият отговор

Простото оцветяване с метиленово синьо оцветява всяка поддаваща се на оцветяване клетка в един и същ син цвят, затова разкрива морфологията (пръчици, сфери, спирали) и разположението (поединично, по двойки, във вериги), но не дава информация за принадлежността към група по Грам. Оцветяването по Грам добавя йод, етап на обезцветяване и контрастно багрило, така че разделя бактериите на грам-положителни (виолетови) и грам-отрицателни (розови или червени) според начина, по който клетъчните им обвивки задържат багрилото. Сините пръчици след метиленово синьо означават „налични са пръчковидни клетки“. Розовите пръчици след пълната последователност по Грам означават „налични са грам-отрицателни пръчици“. Второто твърдение е по-категорично, защото процедурата е включвала допълнителен тест.

За по-широката група методи за оцветяване на бактерии с едно багрило, към която се отнася тази статия, вижте атласа за оцветяване при микроскопия.

Просто оцветяване: едно багрило, един въпрос

Метиленовото синьо е основно (катионно) багрило. Неговият оцветен йон носи положителен заряд и се свързва с отрицателно заредени структури в клетката, включително нуклеинови киселини и киселинни повърхностни групи, така че клетките изглеждат сини на светъл фон. OpenStax описва този принцип на позитивно оцветяване в главата си за оцветяване. Самият катион на багрилото е малкият плосък фенотиазинов йон, подробно описан в химичния справочник за метиленово синьо; хлоридният противойон не участва в оцветяването.

Стандартният учебен протокол е умишлено опростен: направете тънка натривка, оставете я да изсъхне на въздух, фиксирайте я чрез нагряване, залейте я с около 1% воден разтвор на метиленово синьо за приблизително една минута, изплакнете внимателно с вода, подсушете чрез попиване и разгледайте с маслена имерсия. Учебен протокол в LibreTexts посочва точно този вариант с 1% разтвор за една минута, като отбелязва, че някои лаборатории удължават времето. Без байц, без обезцветител, без второ багрило. Именно в това отсъствие е смисълът. Само с едно багрило и без избирателно отстраняване всяка клетка, която свързва багрилото, придобива един и същ цвят.

При E. coli очакваното зрително поле съдържа сини пръчици (бацили), разположени поединично, по двойки или в малки групи. Синият цвят идва от багрилото. Пръчковидната форма идва от организма. Но тази комбинация не идентифицира организма, защото много видове са пръчковидни и много пръчици се оцветяват в синьо при просто оцветяване. ATCC изрично посочва това ограничение до морфологията в своето ръководство за микробиологични култури. Правилният протокол гласи: „наблюдавани са сини бацили“. Всяко твърдение извън формата и разположението изисква още доказателства.

Оцветяване по Грам: четири реагента, един тест за поведение

Оцветяването по Грам е диференциално оцветяване. То подлага всички клетки на една и съща последователност и показва кои задържат първото багрило и кои го губят. Протоколите за оцветяване по Грам на Американското дружество по микробиология определят стандартната последователност от четири стъпки: кристалвиолет (първично багрило), йоден разтвор на Грам (байц), алкохол или смес от ацетон и алкохол (обезцветител), след това сафранин (контрастно багрило).

Стандартният учебен модел обяснява това разделяне чрез структурата на клетъчната обвивка. Грам-положителните клетки имат дебела пептидогликанова стена, която се дехидратира и задържа комплекса кристалвиолет–йод при промиването с алкохол. Грам-отрицателните клетки имат тънък пептидогликанов слой и богата на липиди външна мембрана, която обезцветителят нарушава, така че комплексът се отмива и клетките след това поемат сафранин. Обзорът за оцветяване по Грам в NCBI Bookshelf представя това обяснение, основано на клетъчната стена. Специалистите добавят, че цялостната физикохимия е по-сложна и не се изчерпва с дебелината на стената, но за лабораторната интерпретация правилото за поведението остава валидно: виолетово означава задържане, розово означава загуба на първото багрило и последващо контрастно оцветяване.

Илюстративни панели. Стилизирани рисунки за сравнение на методите, а не микрофотографии, заснети с камера. Цветовете са опростени, за да пояснят логиката: един цвят при просто оцветяване, два цвята след обезцветяване по Грам.

Може ли метиленово синьо да се използва при оцветяване по Грам

Този въпрос има две тълкувания, които изискват различни отговори.

Първо тълкуване: може ли еднократното заливане с метиленово синьо да замени цялата последователност по Грам. Не. Без йод, обезцветител и контрастно багрило няма диференциален етап, следователно не се проверява принадлежност към група по Грам. Синьото поле след използване само на метиленово синьо е резултат от просто оцветяване, дори ако бутилката стои до реагентите за оцветяване по Грам. Не го записвайте като резултат от оцветяване по Грам.

Второ тълкуване: може ли метиленово синьо да замени сафранина като контрастно багрило в стъпка 4. Функционално то може да оцвети обезцветените клетки, а учебна задача предвижда виолетови грам-положителни клетки и сини грам-отрицателни клетки след такава замяна. Логиката е правилна, защото правилно обезцветените грам-отрицателни клетки са почти безцветни и ще поемат друго катионно багрило. Но това не е стандартният протокол. Протоколите на ASM посочват сафранин, с признати алтернативи като основен фуксин в някои варианти, но не и метиленово синьо. Има и практически недостатък: синьото се различава от виолетовото по-трудно, отколкото розовото от виолетовото, особено за начинаещи и особено при износени лампи на микроскопа. За учебна работа и за всеки резултат, който има значение, използвайте контрастното багрило, посочено в протокола ви, обикновено сафранин, и разглеждайте контрастното оцветяване с метиленово синьо като демонстрационен вариант, а не като равностоен стандарт.

Свързаният въпрос за сравнението между метиленово синьо и други възможности с едно багрило е разгледан в сравнение на простите бактериални оцветявания.

Какво доказва оцветяването на E. coli с метиленово синьо и какво не доказва

E. coli е грам-отрицателна пръчица, но това изречение съчетава факти от няколко метода: морфология от микроскопията, реакция по Грам от оцветяване по Грам, идентичност от култивиране плюс биохимични или молекулярни изследвания. Натривката с метиленово синьо допринася само за първата част. Тя установява, че в оцветената проба има пръчковидни клетки и как са разположени. Не установява реакцията по Грам, защото не е проведен тест с обезцветяване. Не идентифицира вида, защото пръчиците на много видове изглеждат еднакво при тази разделителна способност.

Именно тук протоколите допускат предвидима грешка. Авторът пренася предварителни знания („предполага се, че тази култура е E. coli, а E. coli е грам-отрицателна“) в реда за наблюденията, така че препаратът привидно потвърждава нещо, което всъщност е било прието предварително. По-прецизният протокол разделя тези нива: „Просто оцветяване с метиленово синьо: наблюдавани са сини бацили; само морфология, не е проверена принадлежност към група по Грам.“ След това, ако оцветяването по Грам е извършено правилно с контроли: „Оцветяване по Грам: розови пръчици, съответстващи на грам-отрицателна реакция.“ Видовата идентичност се установява по-късно, чрез процедурата за идентификация, а не само по цвета.

Практическо ръководство за интерпретация

Използвайте това правило за преценка в лабораторията. Ако всички клетки са с един цвят и протоколът е използвал едно багрило без обезцветител, извършили сте просто оцветяване. Отчетете формата, приблизителния размер и разположението. Спрете дотам. Ако протоколът е включвал кристалвиолет, йод, обезцветител и контрастно багрило с известни положителни и отрицателни контроли, извършили сте оцветяване по Грам. Отчетете цвета заедно с морфологията: виолетови коки във вериги, розови пръчици и т.н.

Три грешки обясняват повечето обърквания. Първо, прекомерното тълкуване на сините пръчици като потвърждение за E. coli. Второ, записването на препарат с метиленово синьо под заглавието „Оцветяване по Грам“ в лабораторния дневник, което следващите читатели ще изтълкуват погрешно. Трето, необмислената смяна на контрастни багрила и последващото сравняване на цветовете между лаборатории, сякаш цветовите схеми съвпадат. Решението за всяка от тези грешки е едно и също: назовете действително извършения метод и твърдете само онова, което той проверява.

Простото оцветяване има своето място именно защото позволява ограничени заключения. То е бързо, допуска известни отклонения при изпълнение и е достатъчно, когато въпросът е за морфологията: има ли нещо и каква е формата му. Когато въпросът е за класификацията, направете диференциалния тест. Синият препарат ви показва как изглеждат клетките. Виолетовият или розовият препарат ви показва как се държат стените им. Нито един от двата сам по себе си не определя вида.