Оцветяване на клетки от бузата с метиленово синьо: какво да наблюдавате

Ученичка поставя капка суспензия от клетки от бузата върху предметно стъкло, поглежда през микроскопа и не вижда почти нищо. Няколко бледи призрачни очертания преминават през светлото зрително поле. Тя донастройва фокуса, после увеличава осветлението и накрая заключава, че препаратът е празен. Препаратът не е празен. Клетките са там. Те са почти прозрачни и именно тази прозрачност е проблемът, който оцветяването решава.

Струва си да обсъдим това разминаване между очакването и изображението, преди да започнем протокола. Начинаещите очакват микроскопът да разкрива подробности така, както приближаването с фотоапарат разкрива далечна табела. Светлополевият микроскоп прави нещо по-ограничено: показва разлики в поглъщането на светлина. Неоцветената клетка от бузата почти не поглъща светлина и затова създава почти никаква разлика. Метиленовото синьо добавя тази разлика. То се свързва неравномерно във вътрешността на клетката и превръща структурата в контраст. Щом учениците разберат тази идея, всяка следваща стъпка изглежда като логично следствие, а не като рецепта.

Тук помагат основните познания за това как простите оцветявания добавят контраст в училищната лаборатория, а припомнянето на настройването на светлополевия микроскоп преди оцветяване предотвратява половината неуспешни препарати. Химията зад цвета е разгледана във въведението в употребата на метиленово синьо в микроскопията, което обяснява защо това конкретно багрило се среща толкова често на лабораторната маса.

Протокол за работа в час

Описаният по-долу вариант с временен влажен препарат е по-простият стандартен избор за общообразователни занятия. Той не изисква пламък или етап на фиксиране. Вариантът с фиксирана натривка, използван в някои университетски ръководства, добавя изсушаване на въздух и кратко термично фиксиране, както в упражнението с натривка от бузата на North Central Texas College, публикувано в Biology LibreTexts, но термичното фиксиране е обичайна практика в микробиологията, а не изискване за наблюдаване на епителни клетки.

Необходими материали: чисти предметни и покривни стъкла, стерилни тампони за еднократна употреба (за предпочитане) или нови плоски клечки за зъби, шишенце с капкомер с 0.5 до 1 процент воден разтвор на метиленово синьо, дестилирана или дейонизирана вода, попивателна хартия, ръкавици и съставен микроскоп с общо увеличение 100x и 400x.

1. Изплакнете устата с чиста вода. Това отстранява хранителни частици, които по-късно се оцветяват силно и отвличат вниманието от клетките.
2. Всеки ученик взема проба само от собствената си буза. Разтрийте внимателно вътрешната страна на бузата с нов стерилен тампон. Притискайте, не стържете. Спрете много преди да се появят дискомфорт или кървене.
3. Претъркаляйте тампона през центъра на чисто предметно стъкло, така че да остави тънък слой. Тънкият слой е най-важното условие за препарат, който може да се разгледа ясно. Дебело бяло натрупване ще се оцвети в синя маса, в която нищо не може да се различи.
4. Добавете една капка метиленово синьо върху натривката. Оставете за 1 до 3 минути. Една минута е достатъчна в много университетски протоколи; ръководството на NCERT за лабораторни занятия по природни науки за IX клас предвижда около 3 минути за временен препарат. По-дълго не означава по-добре, а прекомерното оцветяване е най-честата грешка при определянето на времето.
5. Изплакнете внимателно с дестилирана вода или отстранете излишното багрило с попивателна хартия според местния протокол. Фонът трябва да стане бледосин, а не тъмносин.
6. Спуснете покривното стъкло под ъгъл, така че първо да се допре единият му ръб, след което го оставете да легне бавно. Това предотвратява образуването на въздушни мехурчета.
7. Започнете с малко увеличение, за да намерите клетките, проверете фокуса и центрирането, след това преминете към 100x и накрая към 400x. При 400x използвайте само финото фокусиране.

Концентрацията на багрилото заслужава кратко уточнение. Училищните протоколи обикновено използват около 1 процент воден разтвор на метиленово синьо. По-концентрираният изходен разтвор или продължителният контакт потъмняват фона по-бързо от ядрото, което обръща контраста, на който се основава упражнението.

Безопасна работа с материал от бузата

Пробите от бузата съдържат слюнка и нормални микроорганизми от устната кухина, затова третирайте всяка прясна натривка като потенциално инфекциозен материал, въпреки че пробите са от здрави съученици. Насоките на Американското дружество по микробиология за биологична безопасност в учебни лаборатории посочват общите принципи: оценете риска преди занятието, носете ръкавици, защитете очите при възможност за пръски, измийте ръцете след това, дезинфекцирайте работните маси и изхвърлете замърсените консумативи по одобрения ред за биологични отпадъци.

Четири правила за работа в час покриват повечето рискове. Един донор за всеки тампон и всяко предметно стъкло — никога не се споделят. Пробата се взема само от себе си, никога от съседа. Тампоните и клечките за зъби за еднократна употреба отиват директно в определения контейнер за отпадъци, никога обратно на масата. Самото метиленово синьо оцветява кожата и дрехите и дразни очите, затова са необходими ръкавици и обичайните хигиенни мерки при работа с багрила. Не разширявайте това упражнение с култивиране на каквото и да било от натривката и не импровизирайте термично фиксиране на пресен човешки материал извън училищната процедура за безопасност.

Какво да наблюдавате и защо изглежда така

При 100x търсете широки плоски клетки, бледосини, с неправилни овални или многоъгълни очертания. Те лежат поединично или в рехави застъпващи се слоеве. Всяка клетка обикновено има едно по-тъмносиньо петно. Това петно е ядрото. Обърнете внимание и на разположението: плоските епителни клетки са като тънки плочки, а не сфери, затова краищата им приличат на напукана глазура, а не на кръгли балони.

При 400x ясно се различават три структури. Границата на клетката се вижда като тънка по-тъмна линия, която я обгражда. Цитоплазмата изпълва вътрешността с равномерен светлосин цвят. Ядрото е по-тъмно и по-компактно, често овално, обикновено близо до центъра, но не винаги. Помолете учениците да отбележат и трите, както и формата и увеличението, защото работният лист изисква точно това.

Тук е важно едно уточнение за точността, което много работни листове пропускат. Видимата граница съответства на областта на плазмената мембрана, но самата мембрана — липиден бислой с дебелина приблизително 7 до 10 нанометра — е далеч под разделителната способност на училищния микроскоп. Учениците виждат оптичния ръб на клетката и натрупаното там багрило. Същата предпазливост е необходима и по отношение на органелите. Митохондриите, ендоплазменият ретикулум, апаратът на Голджи и рибозомите не се виждат в този препарат. При добри условия обикновеният светлинен микроскоп има разделителна способност до приблизително 0.2 микрометра, както обяснява материалът на NCBI по клетъчна биология за микроскопските инструменти, а повечето ултраструктурни детайли са под или близо до тази граница. По-голямото празно увеличение прави изображението по-голямо, без да добавя подробности.

Защо ядрото се оцветява най-тъмно? Метиленовото синьо е катионно багрило, положително заредено в разтвор, и се свързва с отрицателно зареден материал в клетката, преди всичко с нуклеинови киселини. Хроматинът концентрира ДНК в ядрото, затова ядрото натрупва най-много багрило. Цитоплазмата съдържа РНК и други заредени молекули, затова също се оцветява, но по-дифузно и по-светло. Важното уточнение е, че метиленовото синьо не е специфично багрило за ДНК. Изследване върху разпределението на метиленовото синьо при изобразяване на клетъчни ядра описва свързването на катиона с области, богати на нуклеинови киселини, а по-ранно количествено изследване на свързването на метиленовото синьо в клетъчни препарати установява, че по-голямата част от свързаното багрило е свързана с нуклеинови киселини. Следователно тъмното ядро и светлата цитоплазма представляват контрастна картина, а не молекулярен анализ.

Грешките, които учениците ще допуснат, и как да ги разпознават

Почти всеки неуспешен препарат попада в един от пет типа. Научете учениците да установяват проблема с препарата, вместо сляпо да го правят отново.

Прекомерното оцветяване прави клетките и фона еднакво тъмни, така че ядрото се губи в зрителното поле. Коригирайте го с по-кратко време за оцветяване или по-щателно изплакване. Недостатъчното оцветяване оставя призрачни очертания, които изчезват при увеличаване на осветлението; удължавайте времето на стъпки от тридесет секунди. Дебелите натривки образуват плътни застъпващи се маси, в които не може да се проследи нито едно очертание; корекцията е механична — следващия път разстелете по-тънко, защото никакво изплакване не може да спаси купчина клетки. Въздушните мехурчета изглеждат като идеални кръгове с отчетливи тъмни ръбове и разсейват начинаещите, които ги бъркат със структури; поставете покривното стъкло отново, бавно и под ъгъл. Малките тъмни точици, разпръснати върху или около клетките, обикновено са нормални бактерии от устната кухина, както отбелязват училищни протоколи като процедурата на Ingrid Science за клетки от бузата. Те потвърждават, че устата е обитавана, което може да се запомни от учениците, но в това упражнение не могат да бъдат определени до вид и не бива да се рисуват като части на клетката. Хранителните остатъци и нишките слуз се оцветяват неравномерно и силно; предварителното изплакване служи за намаляването им.

Какво не може да покаже това упражнение

Това е учебно наблюдение, а не диагностичен тест. Нищо във външния вид на клетките при учебно оцветяване не може да диагностицира инфекция, рак или каквото и да било заболяване и статията не бива да се възприема като твърдение за обратното. Препаратът показва формата, границата, цитоплазмата и ядрото при две увеличения. Той не показва ултраструктурата на мембраната, подробности на органелите или молекулярна идентичност. Изричното посочване на това ограничение защитава и науката, и учениците: добрият резултат е правилно означена рисунка със записани увеличение и използвано багрило, а не заключение за здравето.

Работен лист за ученици и микрофотографии с означения

Двата материала за това упражнение на страницата са микрофотографията с означения по-горе и работният лист по-долу. Разпечатайте по един работен лист за всеки ученик или го покажете с проектор и помолете учениците да пренесат полетата в тетрадките си.

Как да го използвате в занятие от 45 минути: десет минути за инструктаж по безопасност и вземане на проби, десет минути за оцветяване и изготвяне на препаратите, петнадесет минути за наблюдение и скициране при двете увеличения, десет минути за контролния списък и сравнение с микрофотографията с означения. Елементите в контролния списък са умишлено конкретни и лесни за проверка. Тънка натривка, правилно време за оцветяване, ядро, по-тъмно от цитоплазмата, записано увеличение. Ученик, който може да отметне и четирите, е разбрал идеята, на която е посветен урокът: микроскопите показват разлики, а оцветяванията създават разликите, които си струва да бъдат показани.