Ново метиленово синьо и оцветяване на ретикулоцити: различно багрило и метод за живи клетки

Студент се подготвя за преброяване на ретикулоцити, поръчва метиленово синьо, смесва го с кръв и не вижда почти нищо. Негов колега използва бутилка с етикет „ново метиленово синьо“ и получава ясно очертани сини нишки в част от червените кръвни клетки. Първият студент предполага, че съдържанието на втората бутилка е по-прясно или по-концентрирано. Нито едното, нито другото. Тя съдържа различна молекула.

Именно тази концептуална грешка стои зад повечето обърквания в тази област. Името създава впечатлението, че новото метиленово синьо е подобрена партида метиленово синьо. Химията показва друго. Новото метиленово синьо N е отделно фенотиазиново багрило със собствен номер в Colour Index, собствен модел на заместване и собствена стандартизирана роля в хематологията. След като тази разлика стане ясна, останалата част от метода — защо клетките трябва да са живи при оцветяването, какво се брои за ретикулоцит, какво е мястото на телцата на Хайнц и кога се използва брилянтно крезилово синьо — става лесна за разбиране.

Краткият отговор

Новото метиленово синьо N, използвано като хематологичен реагент, обикновено се идентифицира като Basic Blue 24 в записа на PubChem за ново метиленово синьо, C.I. 52030, CAS 1934-16-3, с формула C18H22ClN3S. Обикновеното метиленово синьо е метилтиониниев хлорид, Basic Blue 9, според неговия запис в PubChem, C.I. 52015, CAS 61-73-4, с формула C16H18ClN3S. В структурно отношение новото метиленово синьо има две метилови групи върху пръстена и етиламино странични вериги там, където метиленовото синьо има диметиламино групи. Тази разлика променя поведението при оцветяване. Хематологичните източници описват обикновеното метиленово синьо като сравнително слабо багрило за ретикулоцити, а новото метиленово синьо — като даващо по-интензивно и по-равномерно оцветяване. Това сравнение е обобщено в тематичната страница на ScienceDirect за ново метиленово синьо.

Да, новото метиленово синьо е суправитално багрило. Суправитално оцветяване означава оцветяване на живи клетки след извеждането им от организма и преди фиксация, както е определено в прегледа на NCBI за принципите на суправиталното оцветяване. И новото метиленово синьо, и брилянтното крезилово синьо принадлежат към тази категория, а стандартът на CLSI за ретикулоцити изрично разглежда новото метиленово синьо като суправитално багрило. Студентите понякога го поставят в една категория с оцветяването по Романовски на фиксирани натривки. Този мисловен модел тук не работи. Ако първо фиксирате, методът престава да работи.

За читателите, които проследяват сходните имена на багрила, статията метилово синьо срещу метиленово синьо разглежда друго, по-съществено объркване между анионно триарилметаново багрило и катионното семейство на фенотиазините. Обзорът на лабораторното оцветяване поставя суправиталните методи в контекста на методите с фиксирани натривки, а ръководството за морфологията на кръвните клетки показва мястото на оценката на ретикулоцитите в по-широката диференциална оценка.

Едно уточнение при работа с каталози: съществува отделна форма на новото метиленово синьо като двойна сол с цинков хлорид под CAS 6586-05-6. Затова в раздела за методите трябва да се посочват солевата форма и доставчикът, а не само общоприетото име.

Какво всъщност прави суправиталното оцветяване

Ретикулоцитът е млада червена кръвна клетка, която е загубила ядрото си, но запазва остатъчна рибозомна РНК. В неоцветен нативен препарат тази РНК е невидима. Суправиталното багрило прониква в живата клетка и преципитира или агрегира тази РНК в сини гранули и нишки — ретикулофиламентозния материал, който се вижда при маслена имерсия. Следователно мрежата е продукт на оцветяването, а не предварително оформен скелет, който чака да получи цвят. Ето защо променливите в протокола — концентрация на багрилото, буфер, съотношение кръв към багрило, температура и време — са толкова важни, колкото и името на багрилото.

Практическото следствие е строго определена последователност: първо смесете кръвта с антикоагулант с багрилото, инкубирайте, след това направете натривки и ги изследвайте без фиксация и без контраоцветяване. Фиксацията преди оцветяване или контраоцветяване, което прикрива бледите нишки, унищожава информацията, на която се основава броенето.

Работен протокол за ретикулоцити с ново метиленово синьо

Няма един-единствен универсален състав, затова посочвайте използвания. Три документирани варианта показват диапазона.

Класическата процедура от тип Brecher използва приблизително 0.5 процента ново метиленово синьо с калиев оксалат, смесено в равни обеми с добре размесена кръв с EDTA и инкубирано около 10 до 15 минути при стайна температура. След внимателно повторно размесване се приготвят тънки клиновидни натривки, изсушават се на въздух и се изследват без фиксация с маслен имерсионен обектив 100x. Процедурата на NCBI за броене на ретикулоцити описва този работен процес и използваната с него рамка за броене.

Вариантът на Dacie и Lewis използва 1.0 процента ново метиленово синьо в цитратен физиологичен разтвор, смесено с 2 до 4 обема кръв и оставено при 37 C за 15 до 20 минути преди приготвянето на натривки. При скорошно прилагане на процедурата CLSI H44 за хармонизация е използван по-разреден разтвор от 0.1 процента във фосфатно буфериран физиологичен разтвор с pH 7.4, с инкубация при 20 C за 10 минути и без фиксация, както е съобщено в проучването за хармонизация на NMB от 2026 г..

Правилата за броене са общи за всички варианти. Отчитайте клетката като ретикулоцит, когато съдържа поне две отделни сини оцветени гранули или сегменти от нишки, което изключва единични отлагания на багрило. При рутинна работа пребройте поне 1,000 червени кръвни клетки и отчетете ретикулоцитите като процент. При ниски проценти статистиката изисква повече клетки. Преглед на методологията CLSI H44 отбелязва, че при около 1 процент ретикулоцити са необходими приблизително 4,400 клетки, за да се намали вариацията при броене до 5 процента, в прегледа на CLSI H44 в De Gruyter. Окулярният диск на Miller прави броенето на голям брой клетки практически изпълнимо. Филтрирайте багрилото или приготвяйте пресен разтвор, защото преципитатът наподобява гранулирани включвания.

Телца на Хайнц в същия препарат

Същата суправитална натривка може да покаже и телца на Хайнц, които представляват агрегати от окислен и денатуриран хемоглобин, а не остатъчна РНК. В препарати с ново метиленово синьо те изглеждат като кръгли телца, често единични и близо до мембраната, оцветени в по-светло синьо от ретикулофиламентозния материал. Те се запазват лошо при фиксация и контраоцветяване, затова изследвайте нефиксираната натривка. Скорошен протокол, използващ 20 микролитра кръв с EDTA и 20 микролитра 1 процент ново метиленово синьо с 15 минути инкубация, определя количествено клетките с телца на Хайнц сред 250 еритроцита, както е описано в проучването в PMC, което представя тази процедура.

Две разграничения предотвратяват погрешното разчитане. Първо, метиловото виолетово и кристалвиолетът оцветяват телцата на Хайнц по-интензивно от новото метиленово синьо, както е отбелязано в тематичната страница на ScienceDirect за телцата на Хайнц. Новото метиленово синьо е удобният избор, когато ретикулоцитите и телцата на Хайнц се оценяват заедно, но не е най-интензивното багрило, предназначено специално за телца на Хайнц. Второ, HbH включванията при носителство на алфа-таласемия образуват многобройни фини точици по цялата клетка след суправитално оцветяване, докато класическите телца на Хайнц са по-малко на брой, по-големи и често свързани с мембраната. Отлаганията на багрило са третият наподобяващ ги артефакт: те се намират извън фокалната равнина на клетките и се различават между зрителните полета.

Брилянтно крезилово синьо срещу ново метиленово синьо

И двете багрила се използват за суправитално оцветяване на ретикулоцити, но стандартизацията дава предимство на едното от тях. Методът за ретикулоцити CLSI H44-A2, разработен съвместно с Международния съвет за стандартизация в хематологията и посочен на страницата за стандарта CLSI H44, определя оцветяването на кръв с EDTA с ново метиленово синьо като ръчния сравнителен метод. Класическото преподаване по хематология е единодушно за външния вид: новото метиленово синьо дава по-интензивно и по-равномерно оцветяване на нишките, докато брилянтното крезилово синьо показва по-голяма вариабилност между партидите и пробите.

Този статут изисква уточнение. Насоките на ICSH за оценка на анализатори приемат ръчната микроскопия с ново метиленово синьо като подход за референтно сравнение, но я определят като субективна и сравнително неточна, като предпочитат референтни процедури с поточна цитометрия, когато са налични. Сравнение на 100 проби от 2022 г. установява по-малко систематично отклонение спрямо използвания анализатор с брилянтно крезилово синьо, отколкото с ново метиленово синьо, както е съобщено в сравнението на методи за оцветяване в PMC. Обоснованото обобщение за студентите е: използвайте новото метиленово синьо като стандартизиран ръчен сравнителен метод, проверявайте всеки местен метод с брилянтно крезилово синьо спрямо него или спрямо автоматизиран метод и очаквайте по-голямо разсейване на резултатите при ръчна микроскопия и в двата случая. По-старата литература за стандартизация също препоръчва пречистен Azure B като химически по-чиста алтернатива поради различията между търговските партиди багрила, в проучването на Marshall за Azure B. Това обяснява защо степента на чистота на реагента все още се обсъжда при разглеждането на методите.

Избягване на типичните грешки

Четири грешки обясняват повечето неуспешни препарати. Поръчването на обикновено метиленово синьо вместо ново метиленово синьо N води до слабо оцветяване по химични причини, а не заради техниката. Фиксирането или контраоцветяването преди разчитане премахва суправиталния сигнал. Броенето на преципитати от багрило като гранули завишава резултата, което се предотвратява с правилото за две гранули и филтрирано багрило. Броенето на твърде малко клетки при ниски проценти ретикулоцити дава число, което изглежда прецизно, но има широки доверителни граници. Всяка грешка има един и същ отличителен белег: микроскопистът обвинява микроскопа за нещо, което е било предопределено на етапа с реагента.